(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202110732177.0 (22)申请日 2021.06.29 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113480662 A (43)申请公布日 2021.10.08 (73)专利权人 北京双因生物科技有限公司 地址 100070 北京市丰台区科 学城海鹰路8 号2号楼1层109室 (72)发明人 段海峰　解晶　张晶　孟文华　 杨继业　 (74)专利代理 机构 北京康思博达知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11426 专利代理师 潘炜　范国锋 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01)C07K 1/22(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/85(2006.01) A61K 38/20(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 35/00(2006.01) 审查员 张娜 (54)发明名称 包含CD40抗体和IL-15的融合蛋白及其制备 方法和用途 (57)摘要 本发明公开了包含细胞因子IL ‑15和CD40抗 体或者免疫活性片段的双特异性融合蛋白及其 制备方法和用途， 所述融合蛋白包括了不同结构 式的人CD40抗体和细胞因子IL ‑15， 由不同质粒 共转染、 表达得到。 本发明公开的融合蛋白可 以 同时激活APC细胞、 T细胞和NK细胞， 增 强细胞因 子的肿瘤靶向性； 能够刺激DC细胞成熟和分泌 IL‑12， 能够显著抑制小鼠黑色素瘤的生长， 减小 黑色素瘤的体积和平均肺转移灶。 权利要求书1页 说明书13页 序列表17页 附图9页 CN 113480662 B 2022.07.22 CN 113480662 B 1.一种多聚体融合蛋白， 其特 征在于， 所述多聚体融合 蛋白由能与CD40结合的单克隆抗体的轻链、 C端连接有细 胞因子IL ‑15 的受体α 的sushi区的能与CD40结合的单 克隆抗体的重链、 细胞因子I L‑15三部分组成， 三部分在ExpiC HO‑S细胞中单独表达， 然后在 细胞内组装成多聚体融合蛋白， 细胞因子IL ‑15的受体α 的sushi区的N端通过连接肽连接在能与CD40结合的单克隆抗 体的重链的C端； 能与CD40结合的单克隆抗体 的轻链的氨基酸序列为SEQ  ID NO： 1所示的氨基酸序列， 能与CD40结合的单克隆抗体的重链的氨基酸序列为SEQ  ID NO： 3所示的氨基酸序列， 细胞 因子IL‑15的氨基酸序列为SEQ  ID NO： 5所示的氨基酸序列。 2.一种多聚体融合蛋白， 其特 征在于， 所述多聚体融合蛋白由两部分组成， 第一部分为能与CD40结合的单链抗体连接Fc区， 再连接细胞因子I L‑15的受体α 的sushi区， 第二部分为细胞因子I L‑15； 两部分在ExpiC HO‑S细胞中单独表达， 然后在 细胞内组装成多聚体融合蛋白， 第一部分的氨基酸序列为SEQ  ID NO： 12所示的氨基酸序列， 第二部分的氨基酸序列为 SEQ ID NO： 5所示的氨基酸序列。 3.权利要求1或2所述的多聚体融合蛋白的制备方法， 其特征在于， 所述制备方法包括 以下步骤： 步骤1， 构建表达融合蛋白的载体； 步骤2， 将构建的表达载体转染细胞； 步骤3， 由细胞中获得表达的融合蛋白； 在步骤3之后， 还 包括步骤4， 对融合蛋白进行 纯化。 4.权利要求1或2所述的多聚体融合蛋白在制备治疗肿瘤药物方面的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113480662 B 2包含CD40抗体和IL ‑15的融合蛋白及其制备方 法和用途 技术领域 [0001]本发明属于生物制药技术领域， 具体涉及包含细胞因子IL ‑15和CD40抗体或者免 疫活性片段的双特异性融合蛋白及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]CD40是一种40～50kDa的I型跨膜糖蛋白， 属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族， 它 广泛表达于各种抗原呈递细胞(APC s)(如树突状细胞DC s)和B淋巴细胞等非免疫细胞(如上 皮细胞和血小板等)， 并且在某些肿瘤细胞表面也有表达。 CD40在细胞和体液免疫中都起到 重要作用。 [0003]CD40与其自然受体CD40L或者激活型CD40抗体结合后， 可以激活APC细胞， 特别是 DC细胞。 激活的DC细胞通过上调其他的共刺激分子(包括主要组织相容性复合物MHCII、 CD80/86等)的表达， 并且下调免疫抑制分子的表达来提高其抗原呈递的能力， 同时增加多 种细胞因子(包括IL ‑12、 INF‑γ)的分泌， 进而进一步增强细胞毒性反应和组织免疫耐受。 通过改进CD40抗体的Fc区可以增 加对FcγRI IB的亲和力， 从而增 加其活性。 [0004]目前， 有多种激活型CD40抗体已进入临床前研究或者临床研究， 在动物模型和肿 瘤患者中都显示出了较强的抗肿瘤免疫反应。 但是， 当前的临床试验还处于早期阶段， 出现 了较多的副作用， 包括I级至II级的细胞 因子综合征、 剂量相关的血液学毒性和肝功能损伤 等。 因此， 现有的CD40抗体药物的安全性 仍然有待商榷。 [0005]细胞因子白介素15(IL ‑15)对NK细胞和CD8+记忆性T细胞的增殖和活化都非常关 键， IL‑15先与IL ‑15Rα 结合， 再与表达IL ‑15Rβ γ的NK细胞和T细胞结合， 将信号反式呈递出 来。 同白介素2(IL ‑2)一样， IL ‑15也是抗肿瘤免疫治疗的热门靶点之一。 但是， IL ‑15并不支 持CD4+CD25+FoxP3调节性T细胞的生长， 并且不会诱导激活CD8+T细胞的凋亡。 目前， 有多个 IL‑15的临床前研究或者临床研究显示出了很好的抗肿瘤活性， 但是， 也存在多个副作用， 如引发包括 促炎性因子的细胞因子级联反应、 参与某些肿瘤的增殖和抑制其凋亡。 [0006]近年来， 抗体 ‑细胞因子融合蛋白代表了新一类的治疗肿瘤的生物药， 目前报道的 抗体‑细胞因子融合蛋白主要都是将抗肿瘤抗原或者基质抗原的抗体与细胞因子融合， 目 的是增强细胞因子的肿瘤靶向性。 此外， 还有将抗人PD ‑1抗体与IL ‑1融合， 通过增强T细胞 和NK细胞的活性来达到抗肿瘤的作用。 但是， 到目前为止， 还未见有抗人CD40抗体与IL ‑15 融合蛋白的报道。 [0007]因此， 亟需提供包含CD40抗体和IL ‑15的融合蛋白， 以同时激活APC细胞、 T细胞和 NK细胞， 且能够应用于实体瘤或者造血系统恶性肿瘤的治疗方面。 发明内容 [0008]为了克服上述问题， 本发明人进行了锐意研究， 制备了具有不同结构式的人CD40 抗体和细胞因子IL ‑15的双特异性融合蛋白， 其可以同时激活APC细胞、 T细胞和NK细胞， 且 该融合蛋白能够有效应用于实体瘤或者造血系统恶性肿瘤的治疗， 从而完成了 本发明。说　明　书 1/13 页 3 CN 113480662 B 3