(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202110766975.5 (22)申请日 2021.07.07 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113481165 A (43)申请公布日 2021.10.08 (30)优先权数据 US63/052,946 2020.07.16 US (73)专利权人 山东博安生物技术股份有限公司 地址 264670 山 东省烟台市高新区科技大 道39号 (72)发明人 周立　萨德哈克·森古普塔 　 阿瓦尼许·瓦许尼　 (51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01) C12N 15/62(2006.01)A61K 35/17(2015.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 US 2019134091 A1,2019.0 5.09 US 2016015749 A1,2016.01.21 WO 2019209991 A1,2019.10.31 CN 110330567 A,2019.10.15 WO 2019178576 A1,2019.09.19 CN 105764505 A,2016.07.13 审查员 张丽玮 (54)发明名称 分泌双特异性T细胞衔接子的CAR-T及治疗 实体肿瘤的应用 (57)摘要 本发明涉及分泌双特异性T细胞衔接子的 CAR‑T及治疗实体肿瘤的应用。 所述分泌双特异 性T细胞衔接子的CAR ‑T， 其靶向第一抗原， 同时 表达和分泌靶向第二抗原的双特异性T细胞衔接 子分子， 该CAR ‑T显示出对表达抗原 的肿瘤细胞 的杀伤力， 以及对肿瘤细胞(包括表达第二抗原 但不表达第一抗原的肿瘤细胞)的整体杀伤力增 强。 本发明进一步涉及生产所述分泌双特异性T 细胞衔接子的CAR‑T的方法。 权利要求书1页 说明书13页 序列表9页 附图9页 CN 113481165 B 2022.06.03 CN 113481165 B 1.一种工程 化免疫细胞， 包括 (a) 嵌合抗原受体(CA R)多肽， 包括与第一肿瘤抗原结合的细 胞外结构域， 所述抗原在 正常组织中表达量低； 以及 (b) 双特异性T细胞 衔接子， 其中所述双特异性T细胞 衔接子与第二肿瘤抗原结合； 其中所述第一肿瘤抗原包括Claudi n18.2或C EA； 其中所述第二肿瘤抗原包括C EA或NKG2D配 体； 所述与第一肿瘤抗原结合的细胞外结构域的氨基酸序列如SEQ  ID NO: 4或SEQ ID  NO: 5所示； 所述双特异性T细胞衔接子的氨基酸序列如SEQ  ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2或SEQ ID  NO: 3所示。 2.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞， 其中所述CAR包括铰链区和跨膜区， 其中所 述铰链区和跨膜区的序列包括CD 8或CD28的跨膜区或铰链区的序列。 3.根据权利要求1 ‑2中任一项所述的工程化免疫细胞， 其中所述CAR包括细胞内信号 区， 其中所述细胞内信 号区的序列包括选自以下序列中一个或多个： CD3ζ、 FcεRIγ、 CD27、 CD28、 4‑1BB、 CD134、 OX40、 CD40、 CD40L、 TLRs、 ICOS、 DAP10和DAP12的细胞内信号区序列。 4.根据权利要求3所述的工程化免疫细胞， 其中与所述第一肿瘤抗原结合的细胞外结 构域的氨基酸序列如SEQ  ID NO: 4所示， 而所述双特异性T细胞衔接子的氨基酸序列如S EQ  ID NO: 1所示； 或者， 其中与所述第一肿瘤抗原结合的细胞外结构域的氨基酸序列如SEQ   ID NO: 5所示， 而所述双特异性T细胞衔接子的氨基酸序列如SEQ  ID NO: 2或SEQ ID NO:  3所示。 5.根据权利要求4所述的工程化免疫细胞， 其中所述免疫细胞选自 以下一种或多种： 原 代T细胞、 NK细胞、 iNKT细胞、 IPS诱导的NK细胞、 脐带血NK细胞、 gamma  delta T细胞、 TCR敲 除T细胞、 病毒特异性T细胞和iP SC衍生T细胞。 6.权利要求1 ‑5任一项所述的工程化免疫细胞在制备治疗实体肿瘤的药物中的应用， 其中所述实体肿瘤选自C EA阳性肿瘤、 Claudi n 18.2阳性肿瘤中的一种或两种。 7.根据权利要求6所述的应用， 其中所述实体肿瘤选自肝癌、 结直肠癌、 胰腺癌、 胃癌、 乳腺癌、 甲状腺髓 样癌、 肺癌、 卵巢癌和泌尿系统肿瘤中的一种或多种。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113481165 B 2分泌双特异性T细胞衔接子的CAR ‑T及治疗实体肿瘤的应用 [0001]相关申请 [0002]本申请要求以下临时申请的权益， 2020年07月16日提交的US63/052,946， 其内容 经此引用全文并入本文。 技术领域 [0003]本发明涉及生物医药领域， 特别涉及细胞治疗领域， 以及分泌双特异性T细胞衔接 子的 CAR‑T， 其靶向第一抗原， 同时表达和分泌靶向第二抗原的双特异性T细胞衔接子分 子。 此外， 本发明涉及特异性地分泌双特异性T细胞衔接子的CAR ‑T， 该CAR‑T显示出对表达 抗原的肿瘤细胞的杀伤力， 以及对肿瘤细胞(包括表达第二抗原但不表达第一抗原的肿瘤 细胞)的整体杀伤力增强。 本发明进一步涉及生产本发 明分泌双特异 性T细胞衔接子的CAR ‑ T的方法。 背景技术 [0004]嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞(CAR ‑T)介导的血液病癌症免疫疗法的成功， 在 其对实体肿瘤的疗效方面还没有得到复制。 阻碍CAR ‑T免疫疗法平台在实体肿瘤中取得成 功的一个重要因素是一种被称为肿瘤细胞的"抗原逃逸"或"免疫逃逸"现象。 当单特异性 CAR‑T细胞被注 射到患者体内时， 这些细胞靶向抗原高的肿瘤细胞， 并成功 地消除这些肿瘤 性细胞。 然而， 现在有一个公认的观察结果， 即在一个给定的肿瘤组织内， 对于任何给定的 抗原， 都存在着抗原 高、 抗原低和抗原阴性的群体。 单一抗原靶向的CAR ‑T细胞只能杀死或 消除抗原高的肿瘤细胞群， 而抗原低/阴性的肿瘤细胞群则没有被杀死。 这将导致这些逃逸 的癌细胞转移和继续 生长， 并将导 致复发。 [0005]双抗原CAR ‑T代表了一种有希望的方法， 通过靶向两种不同的抗原， 最大限度地减 少抗原低或阴性复发(Zah,et  al.,2016,Cancer  Immunol.Res.4(7):639 ‑641； Wilkie,et   al.,2012,J.Clin.  Immunol.32(5):1059 ‑1070)。 为了制备双抗原靶向的CA R‑T， 可以在同 一个T细胞上并行共表达第一个抗原A的CAR和第二个抗原B的CAR； 或者， 可以将抗体(通常 是scFvs)串 联起来， 制备双抗原靶向的CAR ‑T。 这些方法的一个主要缺点是， CAR ‑T细胞的分 布将受到两种抗原的影响和驱动， 而其中一些抗原在各种正常组织中的表达水平可能较 低。 因此， 在体内的生物分布模式是复杂的， 这可能导 致意想不到的严重毒性。 [0006]另一种双靶向方法是在同一个T细胞中表达抗原A的CAR分子和共表达针对抗原B 的双特异性T细胞衔接子。 双特异性T细胞衔接子是合成的抗体分子， 被有目的地设计为通 过CD3 衔接来结合和激活T细胞。 具体来说， 与T细胞上的CD3结合的抗CD3单克隆抗体或单 链可变片段(ScFv)与抗肿瘤分子结合， 所述抗肿瘤分子主要是针对肿瘤抗原的另一个 ScFv， 或者有 时是针对肿 瘤配体的受体， 或针对肿瘤特异性受体的配体。 这些双特异性T细 胞衔接子分子与T细胞结合， “武装”它们以识别和消除肿瘤细胞(Frankel,et  al.,2013, Curr Opin Chem Biol. 17(3):385 ‑392)。 为了克服治疗胶质母细胞瘤的异质性问题， EGFRVIII  CAR‑T细胞已被设计为分泌针对EGFR表达肿瘤细胞的双特异性T细胞衔接子说　明　书 1/13 页 3 CN 113481165 B 3