(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202110733296.8 (22)申请日 2021.06.30 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113462638 A (43)申请公布日 2021.10.01 (73)专利权人 呈诺再生医学 科技 （珠海横琴新 区） 有限公司 地址 519000 广东省珠海市横琴新区豆蔻 路1号粤澳合作中医药科技产业园科 研总部大楼3 01室-066 (72)发明人 吴理达　顾雨春　 (74)专利代理 机构 北京预立 生科知识产权代理 有限公司 1 1736 专利代理师 李红伟　孟祥斌(51)Int.Cl. C12N 5/074(2010.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 35/545(2015.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 37/06(2006.01) A61P 43/00(2006.01) (56)对比文件 CN 10826 5025 A,2018.07.10 CN 112961833 A,2021.0 6.15 审查员 白婧 (54)发明名称 一种高效无遗传修饰的iPSC诱导、 产业化单 克隆挑取平台及应用 (57)摘要 本发明公开了一种高效无遗传修饰的iPSC 诱导、 产业化单克隆挑取平台及应用， 所述平台 能够高效地进行重编程， 并且只需使用最少数量 的重编程因子(OCT4、 SOX2、 E6、 E7)， 本发明在分 离单克隆阶段， 以SSEA4/TRA ‑1‑60为筛选标记， 通过流式细胞分选技术， 获得大量单细胞克隆， 本发明所述平台具有重编程效率高、 安全性高、 操作简单、 可规模化 生产等优点。 权利要求书2页 说明书14页 序列表3页 附图7页 CN 113462638 B 2022.10.25 CN 113462638 B 1.一种体细胞来源的诱导多能干细胞的制备方法， 其特征在于， 所述方法包括如下步 骤： 向体细胞中递送重编程因子组合OCT4、 SOX2、 E 6、 E7； 所述重编程因子组合的递送是通过将重编程因子载体导入体细胞中实现的； 所述重编程因子载体包括将重编程因子组合OCT4、 SOX2、 E6、 E7在骨架载体中编码得到 的重编程因子载体； 所述重编程因子载体包括下列两种重编程因子载体： 编码OCT4和SOX2的载体、 编码E6 和E7的载体； 所述编码OCT4和SOX2的载体中OCT4和SOX2是通过间隔序列IRES 连接， OCT4 ‑IRES‑SOX2 的核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示； 所述编码E6和E7的载体中E6和E7是通过间隔序列IRES连接， E6 ‑E7的核苷酸序列如SEQ   ID NO:2所示； 所述重编程因子载体的用量为： 80~200万体细胞/100  μL中加入0.5 ‑8 μg编码OCT4和 SOX2的载体和编码E 6和E7的载体； 对导入重编程因子载体得到的体细胞进行培养的培养条件为： 在培养第3天时半换液， 使用E8培养基继续培养2 ‑4天后进行全换液， 使用E8 培养基继续培养至形成大量克隆， 得到 的克隆中包 含体细胞来源的诱 导多能干细胞。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述骨架载体为pEGFP  N1。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述导入的方式包括电转染法、 显微注射 法、 基因枪法、 DEAE ‑葡聚糖法、 磷酸钙共沉淀转染法、 人工 脂质体法。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特 征在于， 所述 导入的方式为电转染法。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 将导入重编程因子载体得到的体细胞在细 胞培养板中进行培 养。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 所述细胞培养板为细胞外基质蛋白包被的 培养板。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 所述细胞外基质蛋白包括层粘连蛋白。 8.根据权利要求7 所述的方法， 其特 征在于， 所述层粘连蛋白为人层粘连蛋白 ‑521。 9.根据权利要求5所述的方法， 其特 征在于， 所述细胞培 养板中还包括造血干细胞。 10.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 对得到的克隆进行筛选标记并进行分选， 得到体细胞来源的诱 导多能干细胞。 11.根据权利要求10所述的方法， 其特征在于， 所述筛选标记包括SSEA4、 TRA ‑1‑60、 SSEA1、 TRA ‑1‑81、 SSEA3、 OCT4、 SOX2、 NANO G。 12.根据权利要求11所述的方法， 其特征在于， 所述筛选标记选自SSEA4、 TRA ‑1‑60、 SSEA1、 TRA ‑1‑81。 13.根据权利要求12所述的方法， 其特 征在于， 所述筛 选标记为S SEA4、 TRA ‑1‑60。 14.根据权利要求13所述的方法， 其特征在于， 所述分选是采用流式细胞分选技术进行 的。 15.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述体细胞包括外周单核血细胞、 成纤维 细胞、 脐带血细胞、 成纤维细胞样滑膜细胞、 心肌细胞、 肝细胞、 神经细胞、 造血干细胞、 胰岛 细胞、 胃上皮细胞、 B淋巴细胞、 T淋巴细胞、 脂肪细胞、 胰腺β 细胞、 角质形成细胞、 间充质基权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 113462638 B 2质细胞、 上皮细胞、 内皮细胞。 16.重编程因子组合OCT4、 SOX2、 E 6、 E7在制备体细胞来源的诱 导多能干细胞中的应用。 17.重编程因子载体在制备体细胞来源的诱导多能干细胞中的应用， 其特征在于， 所述 重编程因子载体包括下列两种重编程因子载体： 编码OCT4和SOX2的载体、 编码E6和E7的载 体； 所述编码OCT4和SOX2的载体中OCT4和SOX2是通过间隔序列IRES 连接， OCT4 ‑IRES‑SOX2 的核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示； 所述编码E6和E7的载体中E6和E7是通过间隔序列IRES连接， E6 ‑E7的核苷酸序列如SEQ   ID NO:2所示。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 113462638 B 3