(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202110812255.8 (22)申请日 2021.07.19 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113480651 A (43)申请公布日 2021.10.08 (73)专利权人 华东师范大学 地址 200241 上海市闵行区东川路5 00号 (72)发明人 任华　符智祥　钱旻　何苗壮　 (74)专利代理 机构 上海德禾翰通 律师事务所 31319 专利代理师 夏思秋 (51)Int.Cl. C07K 16/28(2006.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 15/13(2006.01)C12N 1/21(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C07K 1/22(2006.01) A61K 31/537(2006.01) A61K 47/68(2017.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/19(2006.01) 审查员 周振威 (54)发明名称 一种靶向人CD133的纳米抗体及其制备方法 和应用 (57)摘要 本发明公开了一种靶向人CD133的纳米抗体 及其制备方法， 所述方法包括以下步骤： 利用稳 定表达CD133的CHO细胞系作为抗原， 对天然纳米 抗体噬菌体展示库进行筛选， 之后使用野生型 CHO细胞进行负筛， 获得特异性靶向人CD133的纳 米抗体， 将其与人IgG1Fc融合表达并纯化获得纳 米抗体‑Fc融合蛋白。 本发明还公开了将纳米抗 体‑Fc融合蛋白与DM1偶联， 制 备基于CD133纳米 抗体的抗体药物偶联物， 使用CCK ‑8试剂盒检测 其对CD133+肿瘤细胞的细胞毒作用。 本发明制备 的CD133纳米抗体具有良好的抗原结合特异性， 对CD133+肿瘤细胞具有剂量依赖的细胞毒作用。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图4页 CN 113480651 B 2022.07.08 CN 113480651 B 1.一种靶向人CD133的单峰驼纳米抗体， 其特征在于， 所述纳米抗体的碱基序列如SEQ   ID NO.1～2所示， 所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ  ID NO.3～4所示； 所述纳米抗体的碱 基序列SEQ  ID NO.1～2和氨基酸序列SEQ  ID NO.3～4均包 含可变区。 2.一种编码如权利要求1所述的纳米抗体的编码DNA。 3.根据权利要求2所述的编码DNA， 其特征在于， 所述编码DNA的序列为如下1) ‑2)中任 一所述： 1)与SEQ ID NO.1或SEQ  ID NO.2中序列限定的DNA分子杂交且编码如权利要求1所述 抗体的DNA序列； 2)与1)的DNA序列具有90％以上的同源性且编码如权利要求1所述的抗体的DNA序列。 4.一种表达如权利要求1所述的纳米抗体的重组表达载体或表达盒 或转基因细胞系。 5.根据权利要求4所述的重组表达载体或表达盒或转基因细胞系， 其特征在于， 所述重 组表达载体为重组菌 。 6.根据权利要求1所述的纳米抗体或如权利要求4所述的重组表达载体或表达盒或转 基因细胞系在制备 特异性结合人CD13 3的细胞治疗产品中的应用。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 所述细胞治疗产品包括治疗靶向人CD133 的免疫毒素和抗体药物偶联物产品。 8.一种根据权利要求1所述的靶向人CD133的纳米抗体与DM1偶联物的制备方法， 其特 征在于， 所述制备方法包括： 将纳米抗体 ‑Fc融合蛋白与微管抑制剂DM1偶联， 获得基于 CD133纳米抗体的药物偶联物， 以CCK ‑8检测CD133纳米抗体药物偶联物对CD133+细胞的细 胞毒作用。 9.根据权利要求8所述的方法获得的靶向人CD13 3的纳米抗体与DM1的偶联物。 10.根据权利要求9所述的靶向人CD133的纳米抗体与DM1的偶联物在制备肿瘤药物中 的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113480651 B 2一种靶向人C D133的纳米抗体及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于抗体制备技术领域， 涉及一种靶向人CD133的纳米抗体及其制备方法 和应用。 背景技术 [0002]癌症干细胞(CSCs)是肿瘤组织中的一小群细胞， 其可诱导肿瘤的起始和分化， 同 时介导肿瘤 对化疗和放疗的抵抗性， 而这被认为是诱导肿瘤复发的重要原因。 因此， 靶向清 除肿瘤干细胞 可能是治愈肿瘤的重要途径。 [0003]CD133是一个细胞表面糖蛋白分子， 主要定位于细胞质膜的凸起部分， 尤其是基于 胆固醇的脂质微结构域， 其参与膜的组织。 CD133通常被作为肿瘤干细胞分离和鉴定的标志 物， 相比CD44和乙醛脱氢酶(ALDH)等CSC标志物， CD133具有更为局限的表达。 因此， CD133长 期被作为不同实体瘤中恶性祖细胞最为严格的指示物。 相比CD133‑细胞， CD133+细胞通常展 现出更强的自我更新， 增殖， 分化和肿瘤起始能力。 作为CSC s的调节蛋白， CD133可以通过多 种机制调节肿 瘤的发生、 存活、 转移和对治疗的抵抗性， 这些机制如下： (1)CD133是一个胆 固醇结合蛋白， 通过重塑细胞膜胆固醇来诱导脂筏形成从而影响脂质代谢； (2)CD133可以 通过与EGFR直接相互作用稳定EGFR， 上调EGFR ‑Akt信号， 从而促进肿瘤增殖； (3)CD133的胞 质尾可以与p85亚基发生相互作用， 激活PI3K ‑Akt信号， 进而调节肿瘤 发生； (4)CD133可通 过与Src激酶的相互作用激活FAK， 促进癌细胞迁移和转移； (5)CD133可从细胞膜释放进入 胞质， 诱导自噬小体的形成， 促进肿瘤细胞在营养受限等不利条件 下的存活； (6)CD133诱导 的脂滴形成可以上调促进肿瘤发生的Wnt/β ‑catenin信号； (7)CD133可以上调GSH水平使 CD133+细胞对活性氧应激产生抵抗， 从而对化疗药物产生耐受性； 综上所述， CD133调节着 CSCs在肿瘤发生、 发展、 转移和药物抵抗中的方方面面， 有望成为肿瘤靶向治疗的潜在靶 点， 为肿瘤的治愈带来 新的希望 。 [0004]抗体药物偶联物是结合了抗体高度特异性和小分子药物细胞毒作用两种属性的 新型药物， 可以更低的给药剂量实现更好的肿瘤治疗效果， 在肿瘤的靶向治疗中展现出了 非常广阔的前景。 因此， 开发靶向CD133的抗体药物偶联物对肿瘤干细胞进 行定向清除有望 解决当前肿瘤治疗中面临的药物抵抗和复发难题， 为复发和难治性肿瘤的治疗提供新的途 径。 发明内容 [0005]为了解决现有技术存在的不足， 本发明的目的是提供一种靶向人CD133的纳米抗 体、 制备方法及其与DM1偶联物的制备， 对CD13 3+细胞具有细胞毒作用。 [0006]本发明提供了一种靶向人CD133的单峰驼纳米抗体， 所述纳米抗体的碱基序列如 SEQ ID NO.1～2所示， 所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ  ID NO.3～4所示； 所述纳米抗体 的碱基序列SEQ  ID NO.1～2和氨基酸序列SEQ  ID NO.3～4均包 含可变区。 [0007]所述纳米抗体为1G6、 2C 3。说　明　书 1/6 页 3 CN 113480651 B 3