(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202110906277.0 (22)申请日 2021.08.09 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113698493 A (43)申请公布日 2021.11.26 (73)专利权人 北京东方百泰生物科技股份有限 公司 地址 100176 北京市大兴区经济技 术开发 区荣京东 街2号1幢40 6室 (72)发明人 白义　 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) A61K 47/65(2017.01) A61K 47/64(2017.01) A61K 39/395(2006.01)A61K 45/06(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 11/00(2006.01) (56)对比文件 US 2020157180 A1,2020.0 5.21 US 2020157180 A1,2020.0 5.21 CN 110050000 A,2019.07.23 CN 110072885 A,2019.07.3 0 WO 2015149708 A1,2015.10.08 CN 111432828 A,2020.07.17 US 20202316 65 A1,2020.07.23 《GenBan k》 .AOZ485 30. 《GenBan k》 .2016, 《GenBan k》 .AOZ4852 9. 《GenBan k》 .2016, 审查员 张娜 (54)发明名称 一种针对VEGF和TGF-β的双功能蛋白及其 应用 (57)摘要 本发明涉及生物医药领域， 具体提供了一种 针对VEGF和TGF ‑β的双功能蛋白， 包括能够与 VEGF抗原特异性结合的抗V EGF单克隆抗体、 连接 肽linker和TGF ‑βRII胞外结构域多肽， 所述抗 VEGF单克隆抗体通过所述连接肽linker与所述 TGF‑βRII胞外结构域多肽连接。 本发明提供的 针对VEGF和TGF ‑β的双功能蛋白能够靶向VEGF 高表达的肿瘤微环境的同时， 减少TGF ‑β抑制剂 的副作用， 该双功能蛋白不但可 以单用， 还可 以 联用现有的免疫治疗药物如PD ‑1/PD‑L1抑制剂， 均能够有效提高肿瘤疾病的治 疗效果。 权利要求书1页 说明书11页 序列表12页 附图7页 CN 113698493 B 2022.05.31 CN 113698493 B 1.一种针对VEGF和TGF ‑β 的双功能蛋白， 其特征在于， 包括能够与VEGF抗原特异性结合 的抗VEGF单克隆抗体、 连接肽linker和两条TGF ‑β RII胞外结构域多肽， 所述抗VEGF单克隆 抗体通过 所述连接肽l inker与两条 所述TGF‑β RII胞外结构域多肽连接； 所述抗VEGF单克隆抗体包括两条重链和两条轻链， 两条所述TGF ‑β RII胞外结构域多肽 通过所述连接肽linker与所述抗VEGF单克隆抗体的两条所述重链的C末端或N末端分别 连 接； 所述重链的氨基酸序列为SEQ  ID NO:1， 所述轻链的氨基酸序列为SEQ  ID NO:2； 所述 TGF‑β RII胞外结构域多肽的氨基酸序列为SEQ  ID NO:3； 所述连接肽l inker的通式为(G GGGS)n； 其中， 所述 n为4。 2.如权利要求1所述的针对VEGF和TGF ‑β 的双功能蛋白， 其特征在于， 所述双功能蛋白 选自以下任意 一种： 蛋白EB‑1， 其由两条所述TGF ‑β RII胞外结构域多肽通过所述连接肽linker与抗VEGF单 克隆抗体的两条所述重链的C末端分别连接构成， 所述蛋白EB ‑1的重链的氨基酸序列为S EQ  ID NO:4， 其轻链的氨基酸序列为SEQ  ID NO:2； 蛋白EB‑2， 其由两条所述TGF ‑β RII胞外结构域多肽通过所述连接肽linker与抗VEGF单 克隆抗体的两条所述重链的N末端分别连接构成， 所述蛋白EB ‑2的重链的氨基酸序列为S EQ  ID NO:5， 其轻链的氨基酸序列为SEQ  ID NO:2。 3.一种核苷酸分子， 其特征在于， 所述核苷酸分子编码权利要求1或2所述的针对VEGF 和TGF‑β 的双功能蛋白。 4.一种重组DNA表达载体， 其特征在于， 所述重组DNA表达载体包含权利要求3所述的核 苷酸分子 。 5.一种转染如权利要求4所述的重组DNA表达载体的宿主细胞， 其特征在于， 所述宿主 细胞包括原核、 酵母或哺乳动物细胞。 6.权利要求1或2所述的针对VEGF和TGF ‑β 的双功能蛋白在制备治疗肿瘤疾病或纤维化 疾病药物中的应用； 所述肿瘤疾病选自结直肠癌、 非小细胞肺癌、 乳腺癌、 胰腺癌、 肾癌、 胃癌、 肝癌、 卵巢 癌、 黑色素瘤或神经胶质瘤； 所述纤维化疾病包括 肝纤维化和肺纤维化。 7.权利要求1或2所述的针对VEGF和TGF ‑β 的双功能蛋白和免疫调节药物或抗炎症因子 药物联合用于制备治疗肿瘤疾病药物中的应用； 所述免疫调节药物选自抗PD ‑1单克隆抗 体、 抗PD‑L1单克隆抗体、 抗CTLA4单克隆抗体、 抗4 ‑1BB单克隆抗体、 抗OX ‑40单克隆抗体、 抗 PD‑L2单克隆抗体、 抗LAG ‑3单克隆抗体、 抗TI GIT单克隆抗体、 抗GITR单克隆抗体、 抗ICOS单 克隆抗体、 抗PVR单克隆抗体、 抗PVRIG单克隆抗体、 抗VISTA单克隆抗体或抗TIMS单克隆抗 体； 所述抗炎症因子药物选自： 抗TNFa单克隆抗体、 抗IL ‑1β单克隆抗体或IL ‑1受体拮抗 剂、 抗IL‑6R单克隆抗体、 抗 IL‑8单克隆抗体、 重组I L‑15或IL‑15激动剂。 8.如权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述肿瘤疾病选自结直肠癌、 非小细胞肺癌、 乳腺癌、 胰腺癌、 肾癌、 胃癌、 肝癌、 卵巢癌、 黑色素瘤或神经胶质瘤。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113698493 B 2一种针对VEGF和TGF ‑β的双功能蛋白及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物医药技术领域， 特别涉及一种针对VEGF和TGF ‑β 的双功能蛋白及 其应用。 背景技术 [0002]随着生物医药的不断发展， 抗PD ‑1/PD‑L1单克隆抗体的免疫疗法在癌 症治疗领域 取得了重大突破， 例如转移性黑色素瘤、 膀胱癌和非小细胞肺癌等在内的超过15种癌症均 得到了更有效的治疗。 然而， 抗PD ‑1/PD‑L1单克隆抗体也只对20 ‑30％的癌症病人有效， 而 且很多病人即使最开始对治疗有响应， 也会很快发展出耐药性。 同时， 越来越多的证据表 明， 很多癌症都能发展出多种 策略来逃避治疗， 因而需要开发针对癌症的新型免疫治疗手 段。 [0003]研究表明， 肿瘤微环境是 免疫治疗的关键因素， 转化生长因子T GF‑β 是肿瘤微环境 中的一个重要细胞因子， 作为一个多功能的细胞因子， TGF ‑β 不但在细胞的生长、 分化及迁 移等生理活动中都起着重要作用， 而且在癌症的发展中也有着多重功能。 在肿瘤发生阶段， TGF‑β 能抑制肿 瘤细胞的繁殖并促进它们的分化与凋亡， 随着肿瘤进展， 由于TGF ‑β 受体表 达的缺失或下游信号分子的突变， 肿 瘤对TGF‑β 变得不敏感， 这时TGF ‑β 的作用转变为促进 肿瘤的进展。 通过文 献记载， 在大部分癌症中， TGF ‑β 呈过表达状态， 它不但能促进肿瘤细胞 的表皮间质转换(EMT)、 浸润及转移， 还在调节 适应性免疫系统中起着关键作用。 TGF ‑β 不但 能抑制IFN ‑γ的表达、 限制TH1细胞的分化、 减弱CD8+效应T细胞和NK细胞的激活与细胞毒 性、 抑制中央记忆型T细胞的发育， 更重要的是， TGF ‑β 能诱导Treg(一种免疫抑制性CD4 +T细 胞细胞， 在多种癌症中都是较差预后的一个指标)的分化， 此外还有文献记载， 血清中高水 平的TGF‑β 与较差的预后正相关； 而对PD ‑1/PD‑L1抑制剂不应答的首要原因就是肿瘤微环 境中高水平的TGF ‑β 。 [0004]目前， 针对TGF ‑β 靶点的药物开发主要分为三类： 1)阻碍TGF ‑β 与其受体的结合； 2) 阻断TGF‑β信号通路； 3)干扰TGF ‑β 的生成。 但是， 现有的靶向TGF ‑β信号通路的抑制剂是通 过作用于TGF ‑β I型受体激酶或同时抑制三个异构体的活性带来了心脏病毒性， 且在临床可 接受的剂量上未表现出临床有效性， 所以针对靶向TGF ‑β信号通路的抗体药物仍然在不断 的研究中。 [0005]血管内皮细胞生长因子VEGF是肿瘤血管生成过程中的一个主要调节器， 也是另一 个在肿瘤微环 境中起重要作用的蛋白分子， 它和TGF ‑β 在肿瘤微环 境环境中有很多共同点， 例如促进血管生成、 促进转移、 抑制免疫应答、 其高水平表达与较差预后正相关等。 靶向 VEGF的药物主要有贝伐珠单抗(bevacizumab)和阿柏西 普(VEGF trap)， 其中贝伐珠单抗最 早被FDA批准， 并被广泛应用于结直肠癌、 肺癌及肾癌的临床治疗。 然而， 贝伐珠单抗适用症 较少， 副作用较大， 疗效存在争议且容易引起耐药性， 因而有很大的改进空间。 研究发现： 对 VEGF