(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202110715596.3 (22)申请日 2021.06.28 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113388042 A (43)申请公布日 2021.09.14 (73)专利权人 北京鼎成肽源生物技 术有限公司 地址 102200 北京市昌平区双营西路86号 院4号楼1至5层1单元101 (72)发明人 焦顺昌　张嵘　袁翰　吕鹏敏　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 代理人 苏士莹 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C07K 17/14(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 5/0783(2010.01) A61K 35/17(2015.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 31/12(2006.01)(56)对比文件 CN 112608896 A,2021.04.0 6 CN 113493766 A,2021.10.12 CN 109666640 A,2019.04.23 CN 113293132 A,2021.08.24 CN 103756963 A,2014.04.3 0 CN 111690606 A,2020.09.2 2 CN 105238754 A,2016.01.13 CN 104357390 A,2015.02.18 CN 107354133 A,2017.1 1.17 CN 10825 0303 A,2018.07.0 5 王丁丁 等.一种融合 抗体ScFv-Fc通用表达 载体的构建. 《中国生物工程杂志》 .201 1,第31卷 (第8期), Xie 等.A new format of bispecific antibody: highly ef ficient heterodimerizati on, expres sion and tumor cell lysis. 《Journal of Im munological Methods》 .20 04,第296卷(第1-2期), (续) 审查员 郝攀 (54)发明名称 一种重组蛋白、 重组表达载体、 重组细胞和 NK细胞激活磁珠及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明提供了一种重组蛋白、 重组表达载 体、 重组细胞和NK细胞激活磁珠及其制备方法和 应用， 涉及NK细胞激活扩繁技术领域。 本发明将 单链抗体和Strep tag2标签进行融合， 结构简单， 使得重组表达载体或重组细胞表达出的抗体， 无 需进行生物素化修饰就可直接与磁珠进行组装， 且组装后的磁珠可 以直接作为NK细胞的扩增刺 激物， 可以有效的扩增NK细胞。 本发明所述NK细 胞激活磁珠的结合能力高达97％以上， 二者的特 异性高； 利用所述NK细胞激活磁珠激活培养得到 NK细胞系与滋养细胞法激活培养的NK细胞的杀伤效率无明显区别。 [转续页] 权利要求书1页 说明书10页 序列表2页 附图6页 CN 113388042 B 2022.02.01 CN 113388042 B (56)对比文件 李雪莲 等.CD16单抗联合细胞因子 体外扩 增的NK细胞对K5 62杀伤功能研究. 《生物化工》 .2017,第3卷(第4期), Kumada 等.Direct im mobilization of functional single-chain variable fra gment antibodies (scFvs) o nto a po lystyrene plate by genetic fusi on of a po lystyrene- binding peptide (P S-tag). 《Anal Bi oanal Chem》 .2009,第395卷Moutel 等.A multi-Fc -species system for recombi nant antibody producti on. 《BMC Biotechnology》 .2009,第9卷(第14期), McCall 等.Iso lation and characterizati on of an anti- CD16 single- chain Fv fra gment and co nstructi on of an anti-HER2/neu/anti- CD16 bispecific scFv that trig gers CD16 -dependent tumor cytolysis. 《Mo lecular Im munology》 .1999,第 36卷(第7期),2/2 页 2[接上页] CN 113388042 B1.一种NK细胞激活磁珠的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 诱导重组工程细胞产 生重组蛋白， 纯化后与激活的磁珠反应， 得NK细胞激活磁珠； 所述磁珠为Strep ‑Tactin  mag.Microbeads； 所述重组工程细胞的基础细胞包括expiCHO细胞， 所述重组工程细胞的基因组中包含 重组表达载体， 所述重组表达载体的构建方法， 包括以下步骤： (1)在真核表达载体pFUSE ‑hIgG1‑Fc的Fc基因与终止密码子TGA 之间添加Streptag2的 编码基因序列， 得 载体pFUSE ‑hIgG1‑Fc‑Streptag2； (2)将IL21 ‑NM3E2‑IgG1的编码 基因插入 所述载体pFUSE ‑hIgG1‑Fc‑Streptag2的Nco Ⅰ和 BgIⅡ酶切位点之间， 得所述重组表达载体， 所述IL21 ‑NM3E2‑IgG1的编码基因为SEQ  ID  NO.4所示的核苷酸序列。 2.利用权利要求1所述制备 方法制备 得到的NK细胞激活磁珠。 3.权利要求2所述 NK细胞激活磁珠在体外 培养NK细胞中的应用。 4.一种体外培养NK细胞的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 将人外周血单个核细胞与 权利要求2所述 NK细胞激活磁珠按照1:1的数量比混合后进行培 养； 所述培养用的培养基以Human  Lymphocytes  Serum Free Media培养基为基础培养基， 还包括： 1000IU/mL的细胞培养因子IL ‑2、 10ng/mL的细胞培养因子IL ‑15和质量百分含量为 10％的胎牛 血清FBS。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113388042 B 3