ICS 71.100.70 C2682 Y42 上海日用 化学品行业协会 团体标准 T/SHRH 00 6-2018 _________________________________________________________________________________________ 化妆品-自由基（ DPPH）清除实验 方法 Cosmetics -Free Radical (DPPH) Scavenging Test Method 2018-12-01发布 2018-12-30实施 上海日用化学品行业协会 发布 1 目 次 前言…………………………………………………………………………… ……………… 2 1.范围…………………………………………………………………………… …………… 3 2.原理……………………………………………………………… …………… …………… 3 3.仪器…………………………………………………………………… …………… ……… 3 4.试剂………………………………………………………………… ………………… …… 3 5 实验方法 ……………………………………………… ………… ………………………… 3 6.结果计算 ……………………………………………… …………………………………… 4 7.试验有效性验证 ………………………………………… ………………………………… 4 8.结果报告 ………………………………………… ………………………………………… 4 2 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2009给出规则起草。 本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。 本标准起草单位：上海家化联合股份有限公司、 东阿阿胶股份有限公司、 伽蓝（集团）股份有限公 司、上海相宜本草化妆品股份有限公司 、上海中翊日化有限公司 、上海市质量监督检验技术研究院 、玫 琳凯（中国） 有限公司、上海天祥质量技术服务有限公司、上海清轩生物科技有限公司 、汉高（中国） 投资有限公司、广东博溪生物科技有限公司 、上海日用化学品行业协会 。 本标准主要起草人： 陈田、范倩文、曹平 、廖峰、吴建铭、吕智、 孙培文、 林艺青、 戴彦韵、万向 红、李琼、高宏旗、 金坚、陈亦华 3 化妆品-自由基（ DPPH）清除实验方法 1.范围 本标准规定了 自由基（ DPPH）清除实验的基本技术要求。 提供一种 抗氧化原料的评估方法，适用 于宣称具有清除自由基作用的原料的 功效评价。 2.原理 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 （简称DPPH） 是一种稳定的长寿命自由基， 其乙醇溶液呈深紫色， 在 517nm 附近有强吸收。 当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使 DPPH乙醇溶液光吸收减弱。 DPPH乙醇溶液褪色程度与其接受的电子数呈线性关系，由此可评价试验 样品清除自由基的能力， 即抗氧化活性的大小。 3.仪器 分析天平 ：感量 0.1mg； 试管：10mL； 可调节移液枪： 1.00mL； 紫外可见分光光度计 。 4.试剂 除有另外说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的一级水。 95%乙醇； 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 （Sigma公司）； 0.12mg/mL DPPH乙醇溶液： 称取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 12mg于250mL烧杯中， 加入 100mL 95% 乙醇，用玻棒搅拌至溶解，即得； 阳性对照：维生素 E，纯度≥96%。 5.实验方法 阳性对照物用 95%乙醇溶解稀释成： 0.08mg/mL、0.04mg/mL 、0.02mg/mL 、0.01mg/mL 系列浓度梯 度用以验证试验系统。 受试物处理：水溶性 受试物用水稀释为多级浓度样品 ，油溶性 受试物用95%乙醇稀释为多级浓度 样品。 参照表1，使用10mL试管设立样品管（ T）、样品 本底（T0）、DPPH管（C）和溶剂本底 （C0）， 每一样品的每个受试浓度 的样品管（ T）需设立 3支平行管，同时DPPH管（C）也需设立3支平行 管。 在样品管（ T）和样品本底 （T0）中各加入 1mL相同浓度的样品溶液。 4 在所有试管中（T、T0、C、C0）补充溶剂 ，水溶性样品用水，油溶性样品用 95%乙醇，补足3mL， 混匀。 在样品管（T）和DPPH管（C）中加入DPPH乙醇溶液 1mL，样品本底 （T0）和溶剂本底 （C0）用95% 乙醇代替， 轻轻摇匀 ，室温下静置 5分钟。 将各支反应溶液移入 1cm比色皿中，在 517nm处测定吸光值。 表1 样品加液要求 T-样品管 T0-样品本底 C-DPPH管 C0-溶剂本底 样品溶液（ mL） 1 1 — — 水或95%乙醇溶剂（ mL） 2 2 3 3 DPPH乙醇溶液（mL） 1 — 1 — 95%乙醇（mL） — 1 — 1 平行次数 3/样 1/样 3/试验 1/试验 6结果计算 计算DPPH自由基清除率： %100)T-T-1 % 00CC（） 清除率（ …………………………（ 1） （1）式中： T—样品管吸光值，即样品与 DPPH反应后溶液吸光值； T0—样品本底 吸光值； C—DPPH管吸光值3次平均值，即未加样品时 DPPH溶液吸光值； C0—溶剂本底 吸光值。 7.试验有效性验证 每批次实验都需要加入阳 性对照的测试，阳性对照 维生素E的IC50（达到50%清除效果时对应 的样 品受试浓度） 应在0.02mg/mL-0.06mg/mL，则认为试验系统有效 。 根据公式 （1）计算样品在各受试浓度下的 自由基清除率，同时统计 各组平行管间清除率间的标准 差（Standard Deviation ，SD），SD值须≤3%，则认为试验平行性有效。 8. 结果报告 5 样品在某一受试 浓度下的对 DPPH自由基的清除率应表述为： 清除率平均值 ±清除率间的标准差 （SD）。 对于样品清除自由基活性的表述， 不应脱离受试浓度而言。 在进行样品间清除 自由基活性的比较时 ，可绘制样品受试浓度与 DPPH自由基清除率的浓度 反应关 系曲线，应用 拟合公式 （R2≥0.9）计算各样品的IC50，样品IC50越小代表活性越强。 _________________________________________