ICS 11.220 B 41 MA 团体 标准 T/CVMA 12—2018 猪繁殖与呼吸综合征 病毒实时荧光 RT-PCR检测方法 Real -Time RT-PCR for detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus 2018 - 10 - 24发布 2018 - 10 - 24实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 12—2018 I 前 言 本标准按 GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 本标准由中国兽医协会提出并归口。 本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人： 周智、王传彬、杨林、吴佳俊、宋晓晖、翟新验、倪建强、刘玉良、张硕、刘 颖昳、赵柏林、顾小雪、曲萍 。 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 12—2018 1 猪繁殖与呼吸综合征 病毒实时荧光 RT-PCR检测方法 1 范围 本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒 （PRRSV）通用型实时荧光 RT-PCR诊断技术、鉴别美洲型和 欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒 实时荧光 RT-PCR诊断技术。 本标准主要用于 猪繁殖与呼 吸综合征病 毒(PRRSV)核酸的检测 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 25172 猪常温精液生产与保育技术规范 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范执行 3 试剂与耗材 3.1 RNA提取试剂 RNA提取试剂详见附录 A，或选取商品化的病毒 RNA提取试剂盒。 3.2 其他试剂 Taq DNA聚合酶（ 5 U/µL），PrimeScript TM RT MixⅡ反转录酶混合物， 50×ROX Reference Dye Ⅱ, 2×One Step RT -PCR Buffer Ⅲ缓冲液， 无水乙醇，无菌无核酸酶水，生理盐水。 3.3 引物探针 3.3.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒 （PRRSV）通用型实时荧光 RT-PCR引物和探针， 见表1。 表1 猪繁殖与呼吸综合征病毒（ PRRSV）通用型实时荧光 RT-PCR引物和探针序列 名称 序列（5＇-3＇） 美洲型上游引物 （NAF） TGGARATTCATCACCTCCAGR 美洲型下游引物 （NAR） GTGCCGTTRACCGTAGTGGA 欧洲型上游引物 （EUF） ACTTCCAGATGCAGATTGTGT 欧洲型下游引物 （EUR） GCCGTTCACTGATGTTAGTCC 探针 FAM-TACATTCTGGCCCCTGCCCAYCA -BHQ 注：将表中引物和探针用无菌无核酸酶水稀释至 10 pmol/ µL后使用。 3.3.2 美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒双重实时荧光 RT-PCR引物和探针 ,见表2。 表2 美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒双重实时荧光 RT-PCR引物和探针序列 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 12—2018 2 名称 序列（5＇-3＇） 美洲型和欧洲型上游引物 （NAF-EUF） CGCCAGCCAGTCA ATCARC 美洲型和欧洲型下游引物 （NAR-EUR） GRGGAAAATGKGGCTTCTCMG 欧洲型探针 FAM-TCCTCCCCTRGGTTGCTGGCGCT -BHQ 美洲型探针 HEX-YCCCGGTCCCTTGCCTCTGGA -BHQ 注：将表中引物和探针用无核酸酶的灭菌蒸馏水稀释至 10 pmol/ µL后使用。 4 仪器与设备 分析天平、高速离心机、荧光 PCR仪、组织研磨器、 -20℃冰箱、可调移液器。 5 操作步骤 5.1 样品采集 5.1.1 组织样品采集 组织样品采集按照 NY/T 541进行。取病死猪肺脏、 淋 巴结、 扁桃体等组织； 待检活猪， 采集血液 3 mL～ 5 mL，也可采取扁桃体样品 。 5.1.2 公猪精液采集 公猪精液采集按照 GB/T 25172的方法进行 。 5.2 样品的处理 5.2.1 组织样品处理 每份组织分别从三个不同的 典型病变 位置处称取样品约 1 g，剪碎混匀后取 0.02 g于研磨器中研磨， 加入1.5 mL生理盐水继续研磨 ，待匀浆后转至灭菌离心管中， 6 000×g离心2 min，吸取上清液 到新的离 心管备用 。 5.2.2 血液样品处理 将采集的血液室温或者 37 ℃倾斜放置， 待血清析出后 吸取上清液到新的离心管备用 。 5.2.3 精液样品处理 精液样品无需处理，直接用于核酸提取。 5.2.4 阳性对照 样品处理 取美洲型和欧洲型 猪繁殖与呼吸综合征病毒 阳性组织研磨上清 液各100 µL (病毒含量 105.0 TCID 50/mL)，用于病毒RNA提取。 5.2.5 阴性对照 样品处理 取猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性组织研磨上清液 100 µL，用于病毒RNA提取。 5.3 病毒 RNA提取 中国兽医协会 CVMAT/CVMA 12—2018 3 5.3.1 若选用附录 A中所列试剂提取病毒 RNA，则参照以下步骤进行操作 ： a) 取已处理的样品 、阴性对照和阳性对照 各100 µL，分别加入裂解液 600 µL，充分颠倒混匀， 室温静置 3 min～5 min。 b) 将液体吸入吸附柱中 ，10 000×g离心30 s。 c) 弃去收集管中液体，加入 600 µL洗涤液，10 000 g离心30 s。 d) 重复步骤 c)。 e) 弃去收集管中液体， 10 000×g离心2 min，以除去残留的洗涤液。 f) 将吸附柱移入新的离心管中， 向柱中央加入洗脱液 50 µL， 室温静置 1 min，10 000×g离心30 s， 离心管中液体即为模板 RNA。 5.3.2 若使用病毒RNA试剂盒提取病毒 RNA，则按试剂盒说明书进行操作。 5.4 实时荧光 RT-PCR扩增方法 5.4.1 按照表3配制猪繁殖与呼吸综合征病毒 （PRRSV）通用型实时荧光 RT-PCR扩增反应体系。 表3 猪繁殖与呼吸综合征病毒（ PRRSV）通用型实时荧光 RT-PCR扩增反应体系 试剂 体积 无菌无核酸酶水 4.3 µL 美洲型上游引物（ 10 pmol/ µL） 0.9 µL 美洲型下游引物（ 10 pmol/ µL） 0.9 µL 欧洲型上游引物（ 10 pmol/ µL） 0.9 µL 欧洲型下游引物（ 10 pmol/ µL） 0.9 µL 探针（10 pmol/ µL） 0.6 µL 2 × One Step RT -PCR BufferIII 缓冲液 12.5 µL Taq DNA 聚合酶(5µL) 0.5 µL PrimeScriptTM RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 µL 50×ROX Reference Dye Ⅱ 0.5 µL RNA模板 2.5 µL 总体积 25.0 µL 将表3中所有试剂加 入荧光RT-PCR反应管后， 充分混匀， 做好标记。 猪繁殖与呼吸综合征病毒 （PRRSV） 通用型实时荧光 RT-PCR扩增所用 荧光报告基团为 FAM，淬灭基团为 BHQ或None。在荧光 PCR仪上按表4所示 程序进行扩增 反应。 表4 猪繁殖与呼吸综合征病毒 （PRRSV）通用型实时荧光 RT-PCR扩增程序 步骤 温度 持续时间 循环数 1 42 ℃ 5 min 1 2 95 ℃ 10 s 1 3 95 ℃ 5 s 40 4 60 ℃ 35 s 注：在每个循环第二步（ 60 ℃ 35 s）收集荧光信号。 5.4.2 按照表5配制鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光 RT-PCR扩增反应体系。