中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2497.6—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体 互换体外试验 Test method of import and export dangerous chemicals- Part 6: In vitro sister chromatid exchange assay in mammalian cells 2010-03-02发布 2010-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2497.6—2010 前 言 SN/T2497《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为29部分： 第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验； 第2部分：空斑形成细胞(PFC)试验； 第3部分：大型涵繁殖试验； 第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验； 第5部分：睾丸细胞UDS试验； 第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验； 第7部分：小鼠耳肿胀试验； 第8部分：脑窝淋巴结试验； 第9部分：血清溶血素测定试验； 第10部分：T淋巴细胞增殖功能测定试验； 第11部分：种系突变试验； 第12部分：单细胞凝胶电泳分析试验； 第13部分：荧光原位杂交试验； 第14部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验； 第15部分：PCR-SSCP实验； 第16部分：Western-Blot实验； 第17部分：哺乳动物行为毒理学试验； ·第18部分：DNA加合物的检测方法； 第19部分：NorthernBlot实验； 第2o部分：Bradford法测定蛋白质含量； 第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验； 第22部分：DNA的Tm值测定方法； 第23部分：细胞器的分离实验方法； 第24部分：细胞免疫功能体外检测方法； 第25部分：体液免疫功能试验； 第26部分：巨噬细胞功能试验； 第27部分：流式细胞术检测调亡； 第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用； 第29部分：生化需氧量(BOD)测定。 本部分为SN/T2497的第6部分。 本部分修改采用经济合作与发展组织（OECD)化学品测试指南NO.479《哺乳类动物细胞姐妹染色 单体互换(SCE)体外试验》，其有关技术内容与上述方法完全一致，在标准文本格式上按GB/T1.1- 2000做了编辑性修改。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检 疫局。 本部分主要起草人：李宁涛、王利兵、陈练、于艳军、于智睿、李学洋。 本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 1 SN/T2497.6—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体 互换体外试验 1范围 SN/T2497的本部分规定了进出口危险化学品哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换（SCE)体外试验 的试验仪器、试验原理、试验方法和试验结果。 本部分适用于进出口危险化学品导致的染色体同源位点上DNA复制产物互换频率的改变，检测 危险化学品对细胞在S期受损伤的程度 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过SN/T2497的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修行版均不适用手本部分，然而，鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些女件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本 部分。 OECD479哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换（SCE)体外试验 3术语和定义 OECD479确立的以及下列语和定义适用于本部分。 3. 1 姐妹染色单体互换sisterhromatidexchange 染色体同源座位上DNA复制产物的相互交换；其频率与NA的断裂和修复有关。 原理 4 在分裂的细胞中，每条染色体电两条染色单体组成，每条染色单体由双链DNA组成。当溴脱氧尿 嘧啶核苷(BrdU)作为核苷酸前体取代胸腺嘧啶核苷后，可掺人到DNA新复制的核苷酸链中去。经两 次复制后，两条姐妹染色单体的DNA双链在化学组成上就有差别。一条由单股含有BrdU核苷酸链的 DNA所组成，而另一条单体则由双股都含有BrdU核苷酸的DNA所组成。用Hoechst33258染色时， 前者着色深，后者着色浅。当两个等位染色单体间发生交换时，可根据每条染色单体内夹着深浅不同的 染色片段而被识别。 5仪器和试剂 含BrdU的培养基； 秋水仙素或秋水仙胺； -0.25%胰蛋白酶溶液； -2XSSC液（即0.3mol/L氯化钠和0.003mol/L柠檬酸三钠）； 3%吉姆萨液（pH6.8磷酸缓冲液稀释）； -培养箱。 SN/T2497.6—2010 6试验方法 6.1试验细胞准备 验前应检查所用细胞是否被支原体污染并测定其核型的稳定性。采用适合的培养基和培育条件（如温 度，培养用物品，CO2浓度和湿度）。 6.1.2中国仓鼠卵细胞(CHO)平均周期为10h～12h，应培养于含10%胎牛血清的1640培养基中， 每瓶接种3×105个细胞，在处理前24h培养于10mL的新鲜培养液中，于37℃培养。 6.2受试物 6.2.1检测前要测定受试物的可溶性、毒性，并确定剂量水平。 6.2.2对照可选用甲基磺酸乙酯、丝裂霉素C或环磷酰胺。 6.3剂量与分组 6.3.1试验至少设3个受试物剂量水平，另设空白、溶剂对照及阳性对照。 6.3.2每个试验点至少有双份培养样本，并包括有和无代谢活化系统两种情况。 6.3.3高剂量浓度应不损伤细胞损伤的生长能力，同时应确保细胞可以复制；对不溶于水的物质，需确 定适合的赋形剂；受试物相对不溶于水时，应该用其在溶剂中的极限浓度作为最大试验浓度。 6.3.4对易溶于水而无毒性的受试物，其最大浓度应根据具体情况而定。 6.4试验步骤 6.4.1受试物应在细胞的指数生长期与细胞接触（CHO细胞约为种植后12h～14h)，作用时间一般 为1h～2h，也可以延长到两个完整的细胞周期。 6.4.2细胞应在有和无代谢活化系统的培养液中与受试物作用。 6.4.3除去含受试物的培养基，洗涤细胞后加人含BrdU的培养基，加入BrdU后，培养瓶应避光，以 减少掺人了BrdU的DNA发生光解作用。 6.4.4置于37℃、5%～10%CO2孵箱培养，收获经过两个细胞周期后的细胞。收获前1h～4h加人 秋水仙素（终浓度0.4ug/mL~0.6μg/mL)或秋水仙胺（终浓度0.1μg/mL~0.2μg/mL）。 6.4.5培养终止后以0.25%胰蛋白酶溶液消化，收集细胞，用标准细胞遗传学方法制备染色体标本。 6.5染色体准备与着色 6.5.1用荧光加吉姆萨法染色（也可选用其他方法）：标本在0.5μg/mLHoechst33258去离子水中浸 泡12min后用去离子水冲洗，在日光下老化24h后放人60℃的2×SSC（即0.3mol/L氯化钠和 0.003mol/L柠檬酸三钠）液中孵育2h。 6.5.2用蒸馏水冲洗，3%吉姆萨液（pH6.8磷酸缓冲液稀释）染色30min。 6.5.4 每一试验点应记录50个中期细胞。凡在染色单体端部出现的交换记为1个SCE，在染色单体 中间出现的交换记为2个SCE。凡在着丝点部位发生1次交换，判明不是两条染色单体在着丝点部位 发生的扭转，记为1次SCE。 7试验结果 7.1 结果处理 并计算其标准差。试验组与对照组的数据用双侧t检验进行统计学分析。 7.2结果评价 如果至少在一个测试浓度得到可重复的、有统计学意义的SCE频率的增高，或细胞的平均SCE频 率随受试物浓度的增加而增加，且具有统计学意义，则试验结果为阳性。否则可认为该受试物在本测试 2 SN/T2497.6-2010 系统的试验结果为阴性。 试验报告 8 试验报告应包括以下内容： 受试物、溶剂的理化特性。 采用的细胞系及其来源、生长条件及制备、培养方法。 阳性对照物的选择及制备，空白、溶剂对照的设置。 代谢活化系统的制备方法及在试验中使用情况的描述。 处理条件和情况的描述，包括接触浓度的选择、接触持续时间、终止处理的方法。 每份培养标本的平均每个细胞的SCE频率以及每个染色体的平均SCE频率。 显著性检验及相关计算结果。 结果的评价。 SN'T 2497 6—2010 中华人民共和国出入境检验检疫 行业标准 进出口危险化学品安全试验方法 第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体 互换体外试验 SN/T2497.6—2010 中国标准出版社出版 北京复兴门外三里河北街16号 邮政编码：100045 网址www.spc.net.cn 电话：6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本880×12301/16印张0.5字数7千字 2010年5月第一版2010年5月第一次印刷 印数11600 * SN/T2497.6-2010 书号：155066·2-20926 SN'T 2497 6—2010 中华人民共和国出入境检验检疫 行业标准 进出口危险化学品安全试验方法 第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体 互换体外试验 SN/T2497.6—2010 中国标准出版社出版 北京复兴门外三里河北街16号 邮政编码：100045 网址www.spc.net.cn 电话：6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本880×12301/16印张0.5字数7千字 2010年5月第一版2010年5月第一次印刷 印数11600 * SN/T2497.6-2010 书号：155066·2-20926