中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2497.5—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第5部分：睾丸细胞UDS试验 Test method of import and export dangerous chemicals- Part 5:UnscheduledDNA synthesis (UDS) test with testicle cells 2010-03-02发布 2010-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出入境检验检疫 行业标准 进出口危险化学品安全试验方法 第5部分：睾丸细胞UDS试验 SN/T 2497.5—2010 * 中国标准出版社出版 北京复兴门外三里河北街16号 邮政编码：100045 网址www.spc.net.cn 电话：6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本880×12301/16 印张0.5字数10千字 2010年5月第一版 2010年5月第一次印刷 印数1-—1600 书号：155066·2-20925 SN/T 2497.5—2010 前 言 SN/T2497《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为29部分： 第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验； 第2部分：空斑形成细胞(PFC)试验； 第3部分：大型泽繁殖试验； 第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验； 第5部分：睾丸细胞UDS试验； 第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验； 第7部分：小鼠耳肿胀试验； 第8部分：胭窝淋巴结试验； 第9部分：血清溶血素测定试验； 第10部分：T淋巴细胞增殖功能测定试验； 第11部分：种系突变试验； 第12部分：单细胞凝胶电泳分析试验； 第13部分：荧光原位杂交试验； 第14部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验； 第15部分：PCR-SSCP实验； 第16部分：Western-Blot实验； 第17部分：哺乳动物行为毒理学试验； 第18部分：DNA加合物的检测方法； 第19部分：NorthernBlot实验； 第20部分：Bradford法测定蛋白质含量； 第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验； 第22部分：DNA的Tm值测定方法； 第23部分：细胞器的分离实验方法； 第24部分：细胞免疫功能体外检测方法； 第25部分：体液免疫功能试验； 第26部分：巨噬细胞功能试验； 第27部分：流式细胞术检测凋亡； 第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用； 第29部分：生化需氧量（BOD)测定。 本部分为SN/T2497的第5部分。 本部分修改采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试指南NO.486(1997)《体内哺乳动物肝细 胞程序外DNA合成（UDS)试验》，其有关技术内容与上述方法完全一致，在标准文本格式上按 GB/T1.1一2000做了编辑性修改。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检 疫局。 木部分主要起草人：李学洋、王利兵、陈庆俊、于艳军、赵琢、周磊。 本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 I SN/T2497.52010 进出口危险化学品安全试验方法 第5部分：睾丸细胞UDS试验 1范围 SN/T2497的本部分规定了进出口危险化学品的率丸细胞UDS试验的术语和定义、试验原理、试 验程序和试验结果。 本部分适用于进出口危险化学品诱发动物睾丸细胞DNA损伤和修复的检测。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本部分。 2. 1 正修复的细胞cellsinrepair 净核银粒(NNG)高于本试验室历史性阴性对照值的细胞。 2.2 净核银粒netnucleargrains，NNG 在放射自显影UDS试验中细胞内UDS活性的定量测定，计算为核银粒数(NC)减去等于核面积的 细胞质内银粒平均数(CG)，即NNG：NC一CG。由各细胞计算NNG数，再将一个培养物或平行培养物 中的细胞NNG汇总。 2. 3 程序外DNA合成 unscheduledDNAsynthesis,UDS 在切除含有由化学物质或物理因素引起损害的一段DNA后，进行的DNA修复合成。 3原理 睾丸细胞UDS试验是利用哺乳动物作指示生物的体内体细胞遗传毒理学试验，遗传学终点为原发 性DNA损伤。由于本试验检测整个基因组，敏感度较高，对本试验提供致突变活性的信息缺乏特异性 可能有所补偿。 哺乳动物睾丸细胞UDS试验表明，由化学物质或物理因素诱发DNA损伤区经链切除后的DNA 修复合成。本试验通常用放射白显影检测"H-TdR(胸腺嘧啶脱氧核苷）掺人睾丸细胞DNA。与液闪计 数法比较，放射自显影法对S期细胞的干扰不敏感。 4试验方法 4.1准备 4.1.1动物选择 应该利用常用品系的健康刚成年动物。首选大鼠，也可选用其他适当的哺乳动物。在试验开始时， 动物体重差异应不超过每种性别平均体重的士20%。 4.1.2饲养条件 动物室的温度应为22℃土3℃，相对湿度一般维持在30%～70%，除非在清洁动物房，相对湿度最 好控制在50%～60%。光照采用人工照明，12h明暗交替控制。饲以常规实验室饲料，不限饮水。如 果受试物掺人饲料进行染毒，应选择适当的饲料以保证与受试物充分混合。动物可单独饲养或同性别 1 SN/T2497.5—2010 分小组笼养。 4.1.3动物的准备 健康刚成年的动物随机分配到对照组和染毒组，饲养笼也应随机安排，以使饲养笼放置的可能效应 减小。动物应适应试验条件至少5d。 4.2受试物准备 4.2.1受试物处理 固体受试物应溶于或悬浮于适当的溶剂/赋形剂，并于动物染毒前稀释。液体受试物可直接染毒， 或在染毒前稀释。应新鲜制备受试物，除非有稳定性资料证明受试物可以贮存。 4.2.2溶剂/赋形剂 溶剂/赋形剂在所用剂量水平不应产生毒效应，不应与受试物反应。如利用未充分了解的溶剂/赋 形剂，应有其相容性的资料，首选水作溶剂/赋形剂。 4.3剂量与分组 4.3.1剂量水平 4.3.1.1通常设2个剂量组。最高剂量应产生毒性，如根据相同的染毒方案更高剂量可产生动物死 亡。较低剂量一般应为高剂量的50%～25%。在较低的无毒性剂量就有特殊生物活性的物质（如激素 和有丝分裂原)可能是剂量设置标准的例外，并应逐例评价。 4.3.1.2无充足资料时，应进行确定剂量范围试验_应在同实验室利用同一品、系、性别的动物确定 染毒方案。 4.3.2对照 4.3.2.1每个试验都应包括同时进行的阳性对照和阴性(溶剂/赋形剂)对照。除了受试物染毒不同之 外，对照组动物应以与染毒组动物相同的方式进行操作。 4.3.2.2阳性对照在暴露水平应预期得到超过本底值的UDS增加。 阳性对照剂量应使效应很清楚 但并不使读片者立即发现其为阳性对照标本片。阳性对照的染毒途径可以不同于受试物染毒途径。阳 性对照物包括：早期采样（2h～4h），N-二申基亚硝胺（N-NitrQsodimethylamine，CAS号[62-75-9]）；晚 期采样（12h～16h），2-乙酰氨基苏（N-2-Fluorenylacetamide,CS号[$3-96-3])。 4.3.3动物分组数量和性别 4.3.3.1应利用适当的动物数。每组至少有/3只可供分析的劫物。如已有充分的本底对照数据库，则 同时进行的阴性和阳性对照组仅需1只或2只动物。 4.3.3.2如在进行本试验时，已有资料表明同一品系、相同的暴露途径，在不同性别之间毒性无差别， 则用单一性别（优先用雄性)动物即可。当人暴露受试物可能有性别特异性（如某些药物），则应在适当 的性别进行试验。 4.4试验步骤 4.4.1染毒程序 受试物通常采用一次染毒。 4.4.2限度试验 如果单次染毒剂量水平或同一天2次染毒（按体重计）至少2000mg/kg，不产生可观察到的毒性 效应，并且根据结构相关化合物的资料预期受试物无遗传毒性，则不需要进行2个剂量水平的完整试 验。人暴露的预期量可表明需要在限量试验中应用更高的剂量水平。 4.4.3染毒 受试物通常用灌胃或腹腔注射染毒。如果合理，其他的染毒途径也可接受。一次灌胃或注射染毒 的最大液体容积应不超过2mL/100g。若利用更高容积，必须说明理由。除了在较高浓度毒效应增强 的刺激性或腐蚀性物质外，应调整浓度使受试物容积减小，保证在所有的剂量水平为等容积。 2 SN/T2497.5—2010 4.4.4睾丸细胞制备 动物染毒后12h～16h制备睾丸细胞。一般要求有早期采样（染毒后2h～4h），除非在12h～ 16h具有明显的阳性反应。但是，根据已有的毒物代谢动力学资料也可利用其他采样时间。 将双侧睾丸去包膜，放入表面Ⅲ中剪碎，加入匀浆介质（0.01mol/LTris-HCl缓冲液，pH7.4），用 玻璃匀浆器制成10%的睾丸组织匀浆。 4.4.5UDS测定 新分离的哺乳动物睾丸细胞通常在含H-TdR的培养液中培养适当的时间，如3h～8h。在培养 期未，移去培养基后，细胞再培养在含过量未标记胸腺嘧啶的培养液之中，以除去未掺入的放射性：如培 养时间较长可免去此操作。然后，细胞再经淋洗、固定和干燥。标本片浸涂放射自显影乳胶，置于黑暗 中（如冰箱7d～14d)曝光、显影、染色，计数银粒。每个动物制备2个～3个样本片。 4.4.6分析 4.4.6.1标本片应有足够的形态正常的细胞，以进行UDS评价。应在显微镜下检查细胞毒性（如核固 缩、放射标记水平降低）。 4.4.6.2标本片应在读片前编号。每个动物至少从2个标本片计数100