SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2497.28—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用 Test method of import and export dangerous chemicals- Part 28 :Shuttle vector function in detection of mutagenesis 2010-03-02发布 2010-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 数码防伪 SN/T2497.28—2010 前言 SN/T2497《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为29部分： 第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验； 第2部分：空斑形成细胞（PFC)试验； 第3部分：大型潘繁殖试验； 第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验； 第5部分：睾丸细胞UDS试验； 第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验； 第7部分：小鼠耳肿胀试验； 第8部分：胭窝淋巴结试验； 第9部分：血清溶血素测定试验； 第10部分：T淋巴细胞增殖功能测定试验； 第11部分：种系突变试验； 第12部分：单细胞凝胶电泳分析试验； 第13部分：荧光原位杂交试验； 第14部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验； 第15部分：PCR-SSCP实验； 第16部分：Western-Blot实验； 第17部分：哺乳动物行为毒理学试验； 第18部分：DNA加合物的检测方法； 第19部分：NorthernBlot实验； 第20部分：Bradford法测定蛋白质含量； 第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验； 第22部分：DNA的Tm值测定方法： 第23部分：细胞器的分离实验方法； 第24部分：细胞免疫功能体外检测方法； 第25部分：体液免疫功能试验； 第26部分：巨噬细胞功能试验； 第27部分：流式细胞术检测凋亡； 第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用： 第29部分：生化需氧量(BOD)测定。 本部分为SN/T2497系列标准的第28部分。 本部分修改采用《分子克隆》中的相关的检测方法，其有关技术内容与上述方法完全一致，在标准文 本格式上按GB/T1.1做了编辑性修改。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检 疫局。 本部分主要起草人：冯智劫、王利兵、王华、张园、向雪洁、赵好力宝。 本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 I SN/T2497.28—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用 1范围 SN/T2497的本部分规定了进出口危险化学品安全试验中穿梭质粒在突变检验中的应用技术的 术语和定义、试验原理、试验方法和试验结果， 本部分适用于进出口危险化学品安全试验中的致突变性检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过SN/T2497的本部的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。比是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本 部分。 《分子克隆》 3术语和定义 下列术语和定义适用于本部分。 3. 1 穿梭质粒shuttlevector 穿梭质粒是既能依靠质粒基因组在原核细胞中繁殖，又能依靠病毒基因组在真核细胞中复制的一 类质粒。 3. 2 靶基因targetgene 是诱变剂在哺乳动物细胞中作用的靶子，有时女是赋予细胞某种生物特征的选择基因。 3.3 转化transformation 将DNA导人大肠杆菌或酵母细胞，并稳定地整合于基因组中，从而使受体细胞发生永生化改变的 现象。 3. 4 转染transfection 病毒DNA或RNA导人感受态大肠杆菌的过程。也指将任何DNA(包括质粒DNA)或RNA导入 受体细胞的过程。 4试验原理 穿梭质粒除了含有在真核和原核细胞中复制的起点外，穿梭质粒带有对突变敏感的靶基因，将诱变 剂处理的质粒转染哺乳动物细胞或先转染细胞后经诱变剂处理，在细胞内修复和复制后，回收质粒转化 宿主菌，在一定条件下筛选突变子，并进一步对突变子靶基因测序以分析突变的位点、类型、序列特异性 等信息，从而研究诱变剂的诱变机制。由于诱变是在哺乳动物细胞内发生的，因而能够较真实地反映高 等动物的诱变机制；且诱变的发生通过宿主菌显色反应来显示，其任一位置发生的单碱基置换都能从表 SN/T2497.28—2010 型改变表现出来；进一步对突变子靶基因进行序列分析，使表型的改变在DNA分子水平上得到证明， 敏感性极高。 5试验方法 5.1试剂耗材 细胞、质粒及其宿主细菌可根据试验目的进行选择。 一显色剂，需要根据试验目的选择。常用的有：X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）、IPTG （异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）。 基因工程所需的各种试剂和酶。 5.2受试物溶液 试验所需各个浓度受试液通过稀释受试物储备液所得。储备液的配置应采用机械方法（如搅拌或 超声)进行充分溶解。可采用饱和度值（溶解度值)来得到合适浓度的储备液。可使用助溶剂或分散剂。 相应的溶剂对照组不能引起突变。 5.3试验步骤 5.3.1重组质粒的构建鉴定 DNA操作质粒提取、酶切、DNA连接、重组质粒转化等均按《分子克隆》进行。转化到细菌中的重 组质粒经选择基因的筛选，随机挑选其单菌落进行PCR鉴定和核苷酸序列测定。 5.3.2染毒和转染 密度达70%90%备用；于细胞体外直接将不同剂量的受试物溶液37℃作用质粒一段时间（根据质粒 的性质选择作用时间）。需设立对照组。将染毒后的质粒转染至目的细胞。具体方法可根据试验目的 选择，详细方法可按照《分子克隆》进行。然后将转染后的细胞置于含10%小牛血清的DMEM培养基 中常规培养48h～72h后收获质粒。 5.3.3细胞内染毒 将已经转染了质粒的细胞进行培养，当细胞密度达到70%～90%时加入不同剂量的受试物溶液， 避光培养24h～48h，移去受试物溶液，开始收获质粒。 5.3.4细胞内质粒DNA的抽提 可以根据实际情况选择抽提方法。此处介绍Hirt法进行抽提。将转染后的细胞用5mLPBS洗 两遍，15mmol/LTris，10mmol/LEDTA各5mL洗两遍。加裂解液（0.6%SDS，10mmol/LEDTA） 1mL/Ⅲ皿，将脱落的细胞移至eppendorf管，加人5molNaCl使其终浓度为1mol/L，缓慢混匀，4℃放 置8h以上，40000×g离心30min，取上清液用酚氯仿抽提，乙醇沉淀，40000×g离心30min，TE (10mmol/LTris,10mmol/LEDTA)溶解。 5.3.5转染细菌 将抽提的质粒转人宿主细菌，具体方法参见《分子克隆》。常用氯化钙法。 5.4显色反应 5.4.1涂板及培养 将感受态细菌涂布于特定的培养基上，室温放置10min。37℃培养16h～24h，计数转化子。 5.4.2显色 可以根据预先选好的显色方法，判断是否有突变。例如：采用含有X-gal、IPTG和抗性药物的LB 培养基上野生菌落为蓝色，而突变型为白色。分别计数。 5.4.3表型鉴定 2 SN/T 2497.28—2010 验证试验结果。 5.4.4用于筛选突变的穿梭质粒的条件 可以得到含有质粒的克隆细胞。 自身突变率小于10″。 具有较多的转化子。 6试验结果 6.1观察结果 观察结果可填入表1，受试物诱发穿梭质粒的突变频率，其中 突变频率=突变子/转化子 表1 受试物诱发穿梭质粒的突变频率 组别 转化于/个 突变于/个 突变频率 对照 剂量1 剂量2 剂量3 6.2结果分析 根据加入受试物后突变子的增减，判断受试物对质粒突变作用的影响。通过t检验和方差分析等 统计学方法，比较不同剂量之间的差异。 中华人民共和国出人境检验检疫 行业标准 进出口危险化学品安全试验方法 第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用 SN/T2497.28—2010 中国标准出版社出版 北京复兴门外三里河北街16号 邮政编码：100045 网址www.spc.net.cn 电话：6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本880×12301/16 印张0.5字数7千字 2010年5月第一版2010年5月第一次印刷 印数1--1600 书号：155066·2-20934 SN/T2497.28-2010 中华人民共和国出人境检验检疫 行业标准 进出口危险化学品安全试验方法 第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用 SN/T2497.28—2010 中国标准出版社出版 北京复兴门外三里河北街16号 邮政编码：100045 网址www.spc.net.cn 电话：6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本880×12301/16 印张0.5字数7千字 2010年5月第一版2010年5月第一次印刷 印数1--1600 书号：155066·2-20934 SN/T2497.28-2010