中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2497.2—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第2部分：空斑形成细胞(PFC)试验 Test method of import and export dangerous chemicals- Part 2 :Plaque forming cell assay 2010-03-02发布 2010-09-16实施 中华 人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 数码防伪 SN/T 2497.22010 言 前 SN/T2497《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为29部分： 第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验； -第2部分：空斑形成细胞(PFC)试验； 第3部分：大型潘繁殖试验； 第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验； -第5部分：睾丸细胞UDS试验； 第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验； 第7部分：小鼠耳肿胀试验； 第8部分：胭窝淋巴结试验； 第9部分：血清溶血素测定试验； 第10部分：T淋巴细胞增殖功能测定试验； 第11部分：种系突变试验； 第12部分：单细胞凝胶电泳分析试验； 第13部分：荧光原位杂交试验； 第14部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验； 第15部分：PCR-SSCP实验； 第16部分：Western-Blot实验； 第17部分：哺乳动物行为毒理学试验； 第18部分：DNA加合物的检测方法； 第19部分：NorthernBlot实验； 第20部分：Bradford法测定蛋白质含量； -第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验； 第22部分：DNA的Tm值测定方法； 第23部分：细胞器的分离实验方法； 第24部分：细胞免疫功能体外检测方法； -第25部分：体液免疫功能试验； 第26部分：巨噬细胞功能试验； 第27部分：流式细胞术检测凋亡； 第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用； 第29部分：生化需氧量（BOD)测定。 本部分为SN/T2497的第2部分。 本部分修改采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试指南NO.490《空斑形成细胞试验》，其有 关技术内容与上述方法完全一致，在标准文本格式上按GB/T1.1一2000做了编辑性修改。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检 疫局。 本部分主要起草人：李宁涛、王利兵、彭梓、张园、熊中强、张颖。 本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T2497.2—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第2部分：空斑形成细胞（PFC）试验 1范围 SN/T2497的本部分规定了进出口危险化学品安全试验方法空斑形成细胞试验的试验原理、试验 材料、试验程序和试验结果。 本部分适用于检测进出口危险化学品经一次或反复多次接触受试物后，对试验动物体液免疫功能 的影响。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本部分。 2. 1 空斑形成细胞试验 plaqueformingcell assay 细胞悬液混合，将其均匀地悬于半固体琼脂培养基或液体培养基中，在补体的参与下，在红色背景上可 见到透明区，即是抗羊红细胞IgM空斑形成细胞。 2. 2 体液免疫humoralimmunity B淋巴细胞在抗原的刺激下，增殖分化成浆细胞，浆细胞产生并分泌抗原特异性抗体的过程。 3试验原理 空斑形成细胞试验（简称PFC试验），是检测和计数产生IgM、IgG等Ig空斑形成细胞的一种方法， 由于试验具有特异性高、筛检力强、不需要特殊的仪器设备等优点，故可作为判断外源化学物对机体体 液免疫功能影响的指标。 将经羊红细胞（SRBC)免疫4d～5d的小鼠脾脏制成单个细胞悬液，在半固体琼脂凝胶介质中与 围的SRBC产生溶血反应，在其周围形成一个肉眼可见的透明溶血区，称为溶血斑。该方法检出的细胞 主要是IgM空斑形成细胞。为检测分泌抗羊红细胞的IgG抗体形成细胞，需要加入抗IgG的抗体，以 使羊红细胞在加人补体后溶解。 4 材料及试剂 Hanks液、SA缓冲液； 新鲜羊红细胞； 豚鼠血清； 琼脂糖（凝固点42℃）； 一清洁玻片； 试管； 平皿； 不锈钢筛网； SN/T 2497.2—2010 微量取样器； 恒温水浴箱； 温箱； 有凹槽的玻片架。 5试验程序 5.1试验动物 5.1.1选择健康成年小鼠，常用昆明、LACA、BALB/C等品系，雌性与雄性动物均可，鼠龄在6周龄~ 8周龄。 5.1.2动物室温度应维持在22℃士3℃相对湿度为-30%70%，选用常规饲料，自由进食及饮水。 5.2剂量与分组 5.2.1染毒剂量：染毒组一般设3个剂量组，高剂量组为1/5LDs～1/10LDso，低剂量组以不引起任 何免疫毒性，在低、高剂量间设中剂量组。通常组间距为2倍～5倍。 5.2.2按随机方法将动物分为对照组及染毒组，各组动物10只。 5.3染毒 染毒途径及染毒次数依试验目的、人群接触受试物的常见途径及受试物的理化性质而定。 5.4抗原免疫 5.4.1抗原免疫时间可在染毒前、染毒同时及染毒后注射抗原，视受试物对活化细胞还是静止细胞的 影响而定。以羊红细胞为抗原，抗原量通常以（1～5)×10°个为宜。 5.5试验准备 5.5.1抗原 常以SRBC做抗原，用消毒针米刺入羊颈静脉取血，将采集羊血放人有玻璃珠的三角瓶中，充分振 摇，以脱纤维，放人冰箱4℃保存备用，可保存2周 5.5.2免疫动物 取保存的羊血，用生理盐水洗3次，每次离心（200g/min)0min，计数细胞并调整细胞浓度，每只 鼠静脉注射（1~5)×108个羊红细胞。 5.5.3制备补体 从豚鼠股动脉放血或心脏采血，分离血清，使用前用SRBC吸收将压积SRBC1mL加入5mL 豚鼠血清中，置于4℃30min，中间振摇数次，离心取上清液，分装小瓶，置一70℃冰箱保存。 5.5.4玻片涂膜 在玻片上用刷子刷上一薄层0.5%琼脂糖，待干后放片盒可长期保存备用。 5.6试验步骤 5.6.1免疫小鼠脾细胞悬液的制备 将用SRBC免疫过的小鼠在免疫后4d～6d用颈椎脱白法处死，取出脾脏，放在盛有Hanks液的 小平血内。用镊子轻轻撕碎脾脏，制成单个细胞悬液，经2层～4层纱布过滤，以除去大的组织块和结 缔组织，离心(1000r/min)10min，用Hanks液洗两遍细胞，最后将细胞悬浮在5mLHanks液中，即为 免疫脾细胞悬液。 5.6.2试验玻片制备 将表层培养基（1%琼脂糖)加热溶解，放45℃水溶保温，与等量pH7.2~7.4的2倍浓度Hanks 液混合。然后在水浴中分装到小试管，每管0.5mL，再向管内加人10%SRBC(用SA液配制)50μL，随 后加人适量的脾细胞悬液20μL～100μL，充分混匀，迅速倾倒在事先用琼脂糖涂膜的玻片上，待琼脂 凝固后，将玻片倒放在片架上，将装有玻片的架子小心放人特制的盒内，在37℃温箱中温育1h～1.5h。 2 SN/T2497.2—2010 5.6.3加补体 取出温育过的玻片，加人用SA液稀释的补体(1：10），再在37℃温箱内温育1h～1.5h，即可出 现肉眼可见的溶血空斑，计数空斑。 6 试验结果 6.1结果处理 以表格形式列出每只动物编号、性别、体重，动物处死时脾脏重、胸腺重及每张玻片上的空斑形成细 胞数，计算PFC数/10°脾细胞，对染毒组与对照组动物的PFC数/10°脾细胞进行统计比较。 6.2结果评价 根据染毒组与对照组PFC数，评价染毒组动物PFC数/10°脾细胞是否减少，以评定受试物对体液 免疫功能是否有影响及影响的程度。 6.3试验报告 试验报告应包括以下内容： 动物品、系、来源、饲养条件、动物室环境； 受试物的理化性质及配制方法、染毒时间、染毒途径； 羊红细胞来源，取血时间及保存时间和条件； 羊红细胞的处理及配制方法，动物免疫条件包括途径和剂量； 动物处死的时间及方法； 动物开始时体重、结束时体重、脾脏重、胸腺重； 计数玻片上空斑.计算PFC数/10°脾细胞； 统计学分析方法； 结果评价。 6.4结果解释 外源化学物对动物体液免疫功能的影响，多数能引起人体体液免疫功能的变化，但需要用Mishell- Dutton检测方法进行证实。 中华人民共和国出人境检验检疫 行业标准 进出口危险化学品安全试验方法 第2部分：空斑形成细胞(PFC)试验 SN/T 2497.2-2010 中国标准出版社出版 北京复兴门外三里河北街16号 邮政编码：100045 网址www.spc.net.cn 电话：6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印剧 开本880×12301/16 印张0.5字数8千字 2010年5月第一版 2010年5月第一次印刷 印数1—1600 SN/T2497.2-2010 书号：155066·2-20923 中华人民共和国出人境检验检疫 行业标准 进出口危险化学品安全试验方法 第2部分：空斑形成细胞(PFC)试验 SN/T 2497.2-2010 中国标准出版社出版 北京复兴门外三里河北街16号 邮政编码：100045 网址www.spc.net.cn 电话：6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印剧 开本880×12301/16 印张0.5字数8千字 2010年5月第一版 2010年5月第一次印刷 印数1—1600 SN/T2497.2-2010 书号：155066·2-20923