SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2497.19---2010 进出口危险化学品安全试验方法 第 19 部分：Northern Blot 实验 Test method of import and export dangerous chemicals-- Part 19:Test of Northern Blot 2010-03-02发布 2010-09-16实施 中华人民共和国 发布 数码防伪 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2497.19-2010 前言 SN/T2497《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为29部分： 第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验； 第2部分：空斑形成细胞（PFC)试验； 第3部分：大型泽繁殖试验； 第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验； 第5部分：睾丸细胞UDS试验； 第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验； 第7部分：小鼠耳肿胀试验； 第8部分：胭窝淋巴结试验； 第9部分：血清溶血素测定试验； 第10部分：T淋巴细胞增殖功能测定试验； 第11部分：种系突变试验； 第12部分：单细胞凝胶电泳分析试验； 第13部分：荧光原位杂交试验； 第14部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验； 第15部分：PCR-SSCP实验； 第16部分：Western-Blot实验； 第17部分：哺乳动物行为毒理学试验； 第18部分：DNA加合物的检测方法； 第19部分：NorthernBlot实验； 第20部分：Bradford法测定蛋白质含量； 第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验； 第22部分：DNA的Tm值测定方法； 第23部分：细胞器的分离实验方法； 第24部分：细胞免疫功能体外检测方法； 第25部分：体液免疫功能试验； 第26部分：巨噬细胞功能试验； 第27部分：流式细胞术检测凋亡； 第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用； 第29部分：生化需氧量（BOD)测定。 本部分为SN/T2497系列标准的第19部分。 本部分修改采用《分子克隆实验指南》第二版，其有关技术内容与上述方法完全一致，在标准文本格 式上按GB/T1.1--2000做了编辑性修改。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检 疫局。 本部分主要起草人：于艳军、王利兵、李晶、李学洋、赵好力宝、吕刚。 本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T2497.19—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第19部分：NorthernBlot实验 1范围 SN/T2497的本部分规定了进出口危险化学品NorthernBlot实验的主要试剂和材料、主要仪器 设备、试验步骤和结果分析。 本部分适用于检测进出口危险化学品引起的基因转录异常。 术语、定义和缩略语 2 2.1术语和定义 下列术语和定义适用于本部分。 2. 1.1 核酸探针 fnucleicacid probe 能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核苷酸链。 2.2缩略语 下列缩略语适用于本部分 2.2.1MOPS3-(N-玛琳代）丙磺酸 2.2.2RNA核糖核酸 3原理 在变性条件下将待检的RNA样品通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而按其在凝胶中的位置转移 到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA或RNA探针进行杂交和 放射自显影。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，从而显示出 待检RNA的片段及其相对大小。 4试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水为灭菌蒸馏水或超纯水。 4.15×甲醛凝胶电泳缓冲液：0.1mol/LMOPS（pH值7.0），40mmol/L乙酸钠，5mmol/I,EDTA (pH值8.0)。 4.2甲醛凝胶加样缓冲液：50%甘油，1mmol/LEDTA（pH值8.0），0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯 青FF。 4.3溴化乙锭溶液：0.5μL/mL，用0.1mol/L乙酸铵配制。 4.420XSSC溶液：在800mL水中溶解175.3gNaCI和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/LNaOH 溶液调节pH值至7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。 4.52XSSC，由20XSSC溶液稀释而成。 4.6杂交液：50%甲酰胺，5X×SSPE，2×Denhardt试剂，0.1%SDS。 仪器设备 5.1电泳仪。 SN/T2497.19—2010 5.2凝胶成像系统。 6试验步骤 6.1甲醛琼脂糖凝胶电泳 6.1.1制备凝胶：将适量琼脂糖溶于水，冷却至60℃，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液和甲醛至终液浓 度分别为1X和2.2mol/L（将12.3mol/1.甲醛贮存液、琼脂糖水溶液和5×甲醛凝胶电泳缓冲液按 1：3.5：1.1比例混合）。在化学通风橱内灌制凝胶，于室温放置30min或更长时间，是凝胶凝固 6.1.2样品制备： 将以下儿种溶液： RNA(30μg) 4.5ul 5×甲醛凝胶电泳缓冲液 2. 0 μL 甲醛 3.5μL 甲酰胺 10.0 μL 于65℃温浴15min，冰浴冷却，离心5s使管内所有液体集中于管底，加2μl灭菌的并经用DEPC 处理的甲醛凝胶加样缓冲液 6.1.3加样前，将凝胶预电泳5min，电压降为5V/cm，随后将样品加至凝胶加样孔。 6.1.4将凝胶浸人1×甲醛凝胶电泳缓冲液中，（3~4)V/cm电压降进行电泳。 6.1.5 电泳结束后（溴酚蓝迁移出去约8cm），切下相对分子质量标准参照物的凝胶条，浸入溴化乙锭 溶液中染色（30～45)min。在紫外灯下照像，测量照片上每个RNA条带至加样孔的距离，以RNA片段 大小的1g对数值对RNA条带的迁移距离作图，用所得曲线计数从凝胶转移到固相支持体通过杂交所 检出的RNA分子的大小。 6.1.6 毛细管洗脱法将RNA自琼脂糖凝胶转至硝酸纤维素滤膜。 6.1.7将凝胶移至一个玻璃干烤皿内，用刀片修去凝胶的无用部分，做好标记。 6.1.8用长和宽约大于凝胶的一块有机玻璃或一叠玻璃板作为平台，将其放人大干烤皿内，上面放 张滤纸，倒人20×SSC使页面略低于平台表面，当平台上方的3MM滤纸湿透后，用玻棒赶出所有的 气泡。 6. 1.9 裁一张长度和宽度分别比凝胶大1mm的硝酸纤维素滤膜浮在去离子水表面，直至滤膜从下 向上湿透为止，随后用20×SSC浸泡滤膜至少5min，做好标记。 6.1.10将凝胶翻转后置于平台上湿润的滤纸中央，滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。 6.1.11在凝胶上方放置湿润的硝酸纤维素滤膜。滤膜置于凝胶表面适当位置后，就不应轻易移动，滤 膜与凝胶之间不应留有气泡 6.1.12用2×SSC溶液浸湿两张与凝胶同样天小的滤纸，湿润的滤纸放置在湿润的硝酸纤维素滤膜 上方，用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。 6.1.13用保鲜膜在四周封边，切-叠[（5～8)cm高略小于滤纸的纸巾，将其放置在滤纸的上方，并在 纸巾上方放块玻璃板，然后用500g的重物压实。 6.1.14 使上述RNA转移持续进行（6～18)h，每当纸市浸湿后，应换新的纸币。 6.1.15 转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和滤纸，翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜，以凝胶的一面在上，置 于张干的滤纸上，标记凝胶加样孔的位置。 6.1.16 从硝酸纤维素滤膜上剥离凝胶弃之。以6XSSC溶液于室温浸泡滤膜5min。 6.1.17 从6×SSC溶液中取出滤膜，将滤膜上的溶液滴尽后平放在-张纸市上。于室温晾干30mir 以上。 6.1.18 将晾干的滤膜放在两张3MM滤纸中间，用真空炉于80℃干烤（0.5～2)h 6.1.19 仅适用于滤膜上含有乙醛酰RNA的情况：杂交前需要20mmol/LTris·Cl(pH8.0）于65℃ 2 SN/T2497.19—2010 洗膜，除去RNA上的乙二醛分子。 6.2杂交和放射自显影 6.2.1加入杂交液，42℃预杂交（1～2)h。 6.2.2加入变性的放射性标记探针，在适宜温度下继续孵育（16～24)h。 6.2.3用1XSSC、0.1%SDS于室温洗膜20min，随后用0.2×SSC、0.1%SDS于68℃洗膜3次，每 次20min 6.2.4用X光片进行放射自显影，于-70℃曝光（24～48)min。 试验结果 7 用凝胶成像系统对X光片进行拍照、作图，并用图像分析软件进行结果分析。