SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2497.12010 进出口危险化学品安全试验方法 第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外 DNA合成（UDS)试验 Test method of import and export dangerous chemicals- Part 1:Unscheduled DNA synthesis (UDS) test with mammalian liver cells in vivo 2010-09-16实施 2010-03-02发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2497.1—2010 前言 SN/T2497《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为29部分： -第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验； 第2部分：空斑形成细胞(PFC)试验； 第3部分：大型泽繁殖试验； 第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验； 第5部分：睾丸细胞UDS试验； 第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验； 第7部分：小鼠耳肿胀试验； -第8部分：脑窝淋巴结试验； 第9部分：血清溶血素测定试验； 第10部分：T淋巴细胞增殖功能测定试验； 第11部分：种系突变试验； 第12部分：单细胞凝胶电泳分析试验； 第13部分：荧光原位杂交试验； 第14部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验： 第15部分：PCR-SSCP实验； -第16部分：Western-Blot实验； 第17部分：哺乳动物行为毒理学试验； 第18部分：DNA加合物的检测方法； 第19部分：NorthernBlot实验； 第20部分：Bradford法测定蛋白质含量； 第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验； 第22部分：DNA的Tm值测定方法； 第23部分：细胞器的分离实验方法； 第24部分：细胞免疫功能体外检测方法； 第25部分：体液免疫功能试验； 第26部分：巨噬细胞功能试验； 第27部分：流式细胞术检测调亡； 第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用； 第29部分：生化需氧量（BOD)测定。 本部分为SN/T2497的第1部分。 本部分修改采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试指南NO.486(1997)《体内哺乳动物肝细 胞程序外DNA合成（UDS)试验》，其有关技术内容与上述方法完全一致，在标准文本格式上按 GB/T1.1—2000做了编辑性修改。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检 疫局。 本部分主要起草人：贾晓川、王利兵、李宁涛、张园、赵青、熊中强。 本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 I SN/T 2497.1—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外 DNA合成（UDS）试验 1范围 SN/T2497的本部分规定了进出口危险化学品体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验 的术语和定义、试验原理、试验程序和试验结果。 本部分适用于进出口危险化学品体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验检测， 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过SN/T2497的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本 部分。 OECD486体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验 3术语和定义 OECD486确立的以及下列术语和定义适用本部分。 3. 1 净核银粒netnucleargraihs，NNG 在放射自显影UDS试验中细胞内/UDS活性的定量测定，计算为核银粒数(NG)减去等于核面积的 细胞质内银粒平均数(CG)，即NNG:NG一 C。由各细胞计算 NNG数，再将一个培养物或平行培养物 中的细胞NNG汇总。 3. 2 正修复的细胞cellsinrepair 净核银粒(NNG)高于本试验室历史性阴性对照值的细胞。 3. 3 程序外DNA合成unscheduledDNAsynthesis，UDS 在切除含有由化学物质或物理因素引起损害的一段DNA后，进行的DNA修复合成。 4试验原理 体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验的目的是为了鉴定能诱发染毒动物肝细胞 DNA修复的物质。 体内试验提供了一种研究化学物质肝脏遗传毒性效应的方法，测试的终点表明肝细胞发生DNA 损伤及随后发生的修复。肝脏是机体吸收的化学物质代谢的主要器官，因此肝脏是检测体内DNA损 伤的适宜部位。 化学或物理因素诱发DNA损伤后，细胞启动程序外DNA合成程序以切除或移除DNA损伤的区 域，体内哺乳动物肝细胞UDS试验就是检测受损DNA的修复合成过程。肝细胞周期中处于S期频率 1 SN/T2497.12010 很低，因此本试验通常用放射自显影检测3HI-TdR(胸腺嘧啶脱氧核苷）掺人肝细胞DNA。与液闪计数 法比较，放射自显影法对S期细胞的干扰不敏感。 5试验方法 5.1试验动物 5.1.1动物选择 应该利用常用品系的健康刚成年动物。首选大鼠，也可选用其他适当的哺乳动物。在试验开始时， 动物体重差异应不超过每种性别平均体重的士20%。 5.1.2饲养条件 动物室的温度应为22℃±3℃、相对湿度一般维持在30%～70%，除非在清洁动物房，相对湿度最 好控制在50%～60%。光照采用人工照明，12h明暗交替控制。饲以常规实验室饲料，不限饮水。如 果受试物掺入饲料进行染毒，应选择适当的饲料以保证与受试物充分混合。动物可单独饲养或同性别 分小组笼养。 5.1.3动物的准备 健康刚成年的动物随机分配到对照组和染毒组，饲养笼也应随机分配，以使饲养笼放置的可能影响 效应减小。动物应适应试验条件至少5d。 5.2受试物准备 5.2.1受试物处理 固体受试物应溶于或悬浮于适当的溶剂/赋形剂，并于动物染毒前稀释。液体受试物可直接染毒， 或在染毒前稀释。应新鲜制备受试物，除非稳定性资料证明可以贮存。 5.2.2溶剂/赋形剂 溶剂/赋形剂在所用剂量水平不应产生毒效应，不应与受试物反应。如利用未充分了解的溶剂/赋 形剂，应有其相容性的资料，推荐首先考虑使用水性溶剂/赋形剂。 5.3剂量与分组 5.3.1剂量水平 5.3.1.1通常设2个剂量组。最高剂量应产生毒性，如根据相同的染毒方案更高剂量可产生动物死 亡。较低剂量一般应为高剂量的50%～25%。在较低的无毒性剂量就有特殊生物活性的物质（如激素 和有丝分裂原)可能是剂量设置标准的例外，并应逐例评价。如无适当的资料，需进行确定剂量范围试 验，应在同一实验室利用同一品、系、性别的动物和染毒方案。 5.3.1.2最高剂量也可规定为引起肝脏某些毒性（如核固缩）的剂量。 5.3.2对照 5.3.2.1每个试验都应包括同时进行的阳性对照和阴性（溶剂/赋形剂)对照。除了受试物染毒不同之 外，对照组动物应以与染毒组动物相同的方式进行操作。 5.3.2.2阳性对照在暴露水平应预期得到超过本底值的UDS增加。阳性对照剂量应使效应很清楚， 但并不使读片者立即发现其为阳性对照标本片。阳性对照的染毒途径可以不同于受试物染毒途径。阳 性对照物包括：早期采样（2h~-4h），N-二甲基亚硝胺（N-Nitrosodimethylamine，CAS号[62-75-9]），晚 期采样（12h～16h），2-乙酰氨基苏（N-2-Fluorenylacetamide，CAS号[53-96-3])。 5.3.3动物的数量和性别 5.3.3.1应利用适当的动物数。每组至少有3只可供分析的动物。如已有充分的本底对照数据库，则 同时进行的阴性和阳性对照组仅需1或2只动物。 2 SN/T2497.1—2010 5.3.3.2如在进行本试验时，已有资料表明同一品系、相同的暴露途径，在不同性别之间毒性无差别， 则用单一性别（优先用雄性)动物即可。当人暴露于受试物可能有性别特异性（如某些药物），则应在适 当的性别进行试验。 5.4试验步骤 5.4.1染毒程序 受试物通常采用一次染毒。 5.4.2限度试验 如果单次染毒剂量水平或同一天2次染毒的剂量水平（按体重计）达到至少2000mg/kg，未观察 到毒性效应，并且根据结构相关化合物的资料表明受试物无遗传毒性，则不需要进行2个剂量水平的完 整试验。除非人类暴露的受试物的资料表明需要在限度试验中使用更高的剂量水平。 5.4.3染毒 受试物通常用灌胃或合适的进行插管套管经口染毒。只要证明合理也可采用其他的染毒途径。一 次灌胃或注射染毒的最大液体容积应不超过2mL/100g。若利用更高容积，必须说明理由。除了刺激 性或腐蚀性物质（通常刺激性作用会随浓度的升高而加重)外，应当通过调整浓度使受试物的体积差别 降到最低，使所有剂量水平的受试物体积保持相同。 5.4.4肝细胞制备 5.4.4.1动物染毒后12h16h制备肝细胞。除非在12h～16h具有明显的阳性反应，一般应增加 早期采样时间（一般在染毒后2h～4h）。也可根据已有的毒物代谢动力学资料，利用其他采样时间。 5.4.4.2通常采用胶元酶原位灌注肝，分离肝细胞，贴壁后，进行哺乳动物肝细胞短期培养。阴性对照 动物的肝细胞存活率应至少在50%以上。 5.4.5UDS标本制备 新分离的哺乳动物肝细胞通常在含3H-TdR的培养液中培养3h～8h。在培养期末，移去培养基 后，细胞再培养在含过量未标记胸腺嘧啶的培养液之中，以除去未掺人的放射性。如