SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4656.6—2017 进出口纺织品生物安全检验方法 第6部分：沙门氏菌 Biosafety testing methods of the textiles for import and export- Part 6 : Salmonella 2017-11-07发布 2018-06-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫 行 业 标 准 进出口纺织品生物安全检验方法 第6部分：沙门氏菌 SN/T4656.6—2017 中国标准出版社出版 北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029) 北京市西城区三里河北街16号（100045） 总编室：（010)68533533 网:www.spc.net.cn 中国标准出版社秦皇岛印刷广印刷 开本880×12301/16 印张1.25 字数34千字 2018年7月第一版2018年7月第一次印刷 印数1~500 * 书号：155066·2-44561 定价21.00元 SN/T4656.6—2017 前言 SN/T4656《进出口纺织品生物安全检验方法》共分为6个部分： 第1部分：白假丝醇母菌； 一第2部分：大肠埃希氏菌； 一第3部分：大肠菌群； -第4部分：金黄色葡萄球菌； 一第5部分：菌落总数； 第6部分：沙门氏菌。 本部分为SN/T4656的第6部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国河南出入境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检 疫局。 本部分主要起草人：李辑、郭会清、禹建鹰、徐超、王蕾、张勤、苗丽、乔晴、孙晓霞。 SN/T4656.6—2017 进出口纺织品生物安全检验方法 第6部分：沙门氏菌 1范围 SN/T4656的本部分规定了进出口纺织品中沙门氏菌的检验方法。 本部分适用于进出口纺织品沙门氏菌的检验。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T1538.2培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 纺织品生物安全biosafetyoftextiles 纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁，及对其所采 取的一系列有效预防和控制措施。 3.2 沙门氏菌Salmonella 一种人畜共患病的病原菌，是一种革兰氏阴性肠杆菌。此菌营养要求不高，自然界分布极为广泛， 可在食品、水、土壤、动物毛发、纤维中检出，可感染人和多种动物，大部分具有很强的致病性。目前所发 现的沙门氏菌血清型有近3000个，其中许多血清型菌能在人和动物之间交叉感染，能引起人和动物的 多种不同临床表现，主要引起发热、胃肠炎、腹泻和败血症等，给人类的健康造成了严重的危害。 3.3 环介导恒温扩增loop-mediatedisothermalamplification；LAMP 根据目标菌特有的靶序列保守基因设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的六个独立 区域，利用BstDNA聚合酶启动循环链置换反应，在等温条件（63℃左右）下保温30min～60min特 异、高效、快速的完成核酸扩增。从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产 物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。 4设备、材料 4.1常规微生物检测用的基本设备与材料。 SN/T4656.6—2017 4.2 无菌剪刀、镊子。 4.3 电子天平：感量为0.01g。 4.4 无菌均质袋。 4.5 拍击式均质器：400mL。 4.6 无菌规格板：20cm²。 4.7 无菌干燥棉拭子。 4.8 恒温培养箱：36℃±1℃、42℃±1℃。 4.9 全自动微生物生化鉴定系统。 4.10 接种环。 4.11 载玻片。 4.12 微量移液器：量程1μL~20μL；量程200μL~1000μL。 4.13 灭菌离心管：1.5mL。 4.14 LAMP反应管。 4.15 高速离心机：2000r/min~13000r/min。 4.16 水浴锅：63℃士1℃。 4.17 LAMP实时浊度仪。 5 培养基、试剂 5.1 SCDLP液体培养基：见附录A中A.2。 5.2 氯化镁孔雀绿肉汤：见A.3。 5.3 亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC)：见A.4。 5.4 亚硫酸铋琼脂（BS）：见A.5。 5.5 沙门氏菌显色培养基。 5.6 营养琼脂：见A.6。 5.7 三糖铁（TSI)琼脂：见A.7。 5.8 赖氨酸脱羧酶培养基和赖氨酸脱羧酶对照培养基：见A.8。 5.9 尿素琼脂（pH7.2）：见A.9。 5.10 V-P半固体琼脂：见A.10。 5.11 V-P反应甲液：见A.11。 5.12 V-P反应乙液：见A.12。 5.13 吲哚培养基：见A.13。 5.14 柯凡克试剂：见A.14。 5.15 β-半乳糖苷酶试剂：见A.15。 5.16 生化鉴定试剂盒。 5.17 无菌生理盐水：见A.16。 5.18 沙门氏菌（）多价抗血清。 5.19 沙门氏菌H多价抗血清。 5.20 沙门氏菌Vi抗血清。 5.21 灭菌双蒸水。 5.22 10×LAMP扩增缓冲液：含200mmol/l.Tris-HCl（pH8.8）、100mmol/L硫酸铵、500mmol/l 氯化钾、20mmol/L.硫酸镁、1%Tween20。 5.23 引物：根据沙门氏菌属的invA基因保守序列，设计一套LAMP特异性引物。 2 SN/T 4656.6--2017 外引物F3：5'-ACCGTGGTCCAGTTTATCGT-3 外引物B3：5'-CACCGTCAAAGGAACCGTAA-3 内引物BIP:5'-TGCCGATTTGAAGGCCGGTA-TTTCCAGTACGCTTCGCC-3 环引物L00pF：5'-ATCGGGCCGCGACTTCCGCGA-3 环引物Lo0pB：5'-TTGATGCGGATGCCGCGCGCG-3 5.24100mmol/LMgSO。 5.2510mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）混合物：每种核苷酸浓度10mmol/L。 5.26BstDNA聚合酶：8U/μL。 5.27显色液：SYBRGreenI染料，1000X。 5.28沙门氏菌标准菌株。 注：除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；分子检测实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。 6样品制备 6.1称量法 无菌方法打开送检样品，用无菌剪刀（4.2）均匀剪样，在电子天平（4.3）上准确称取剪下的样品 25g，剪碎后加人到盛有225mLSCDLP液体培养基（5.1)的无菌均质袋（4.4)中，用拍击式均质器（4.5） 拍打1min～2min，充分混匀。 6.2多点采样洗脱法 无菌方法打开送检样品，在样品四周和中间均勾布控5个采样点，用无菌规格板（4.6）按每个采样 点按4cm×5cm（20cm²）面积范围剪裁，每20cm²采样面积为1份检样，每件样品共采集5份检样，采 样面积为100cm²。将上述采集好的5份检样放入盛有200mLSCDLP液体培养基（5.1）的无菌均质 袋（4.4)中，用拍击式均质器（4.5)拍打1min～2min，充分混匀，得到一个灭菌洗脱液。 6.3棉拭子涂抹法 无菌方法打开送检样品，用SCDLP液体培养基（5.1）湿润无菌干燥棉拭子（4.7），在样品四周和中 间均匀布控5个采样点，用无菌规格板（4.6）比照按每个采样点20cm²面积范围均匀涂抹，每个采样点 用1个无菌干燥棉拭子（4.7），在4cm×5cm（20cm"）面积范围均匀涂抹，立即用无菌剪刀（4.2），剪去 棉拭子手接触部分，将涂抹部分一块放入盛有50mLSCDLP液体培养基（5.1）的无菌均质袋（4.4）中 混匀。 6.4样品制备方法的选择 6.4.1样品制备一般依6.1方法，25g样品十225mLSCDLP液体培养基（5.1）为基准方法。 6.4.2当样品为面积较大或较厚实或多孔时，样品制备应采用6.2方法。采用6.2方法时如果被检样 品面积过大或过小，采样点可按比例增加或减少。 方法。 6.4.4采用6.1、6.2方法时，如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样品均液转种，稀释液 SCDLP液体培养基（5.1)可适当增加直至足够吸出转种。 3