以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5335 —2020 非洲猪瘟检测实验室生物安全 操作技术规范 Technical specifications of biosafety operations for laboratory testing African swine fever 2020-12-30发布 2021-07-01 实施ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5335—2020前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020 给出的规则起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国青岛海关、中华人民共和国上海 海关、中华人民共和国北京海关、中华人民共和国大连海关、中华人民共和国长春海关、中华人民共和国深圳海关、中华人民共和国广州海关、中华人民共和国长沙海关、中华人民共和国重庆海关。 本文件主要起草人：罗宝正、王群、陈轩、张强、乔彩霞、邵建宏、罗佳、孟日增、曹琛福、 佟铁铸、李健、刘艳华、朱忠武、李应国、王伟利、薄清如。 I以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5335—2020非洲猪瘟检测实验室生物安全操作技术规范 1 范围 本文件规定了非洲猪瘟检测实验室生物安全基本要求，包括样品接收和管理、样品处理、样品 检测、废弃物和验余样品无害化处理、设施及环境消毒处理和初筛阳性样品传递。 本文件适用于非洲猪瘟检测实验室的相关活动。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 GB/T 18648 非洲猪瘟诊断技术 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 SN/T 1559 非洲猪瘟检疫技术规范 病原微生物实验室生物安全管理条例（国务院令第 424 号）高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范（农业部公告第 503 号）世界动物卫生组织（OIE）陆生动物诊断试验与疫苗手册 （2019 版）联合国粮食和农业组织（FAO）动物生产与卫生手册（2018 版） 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 实验室生物安全基本要求 4.1 非洲猪瘟病毒属于高致病性动物微生物，相关资料参见附录 A。根据国务院第 424 令第三十条规 定，从事高致病性病原微生物分离和动物体上相关实验活动的，应在生物安全三级以上实验室进行。4.2 开展非洲猪瘟病毒核酸和抗体检测的实验室，其设施设备配置应符合 GB 19489 中生物安全二级 （BSL -2）及以上实验室的要求。样品灭活前的实验活动应在生物安全柜中操作，废弃物及检测完样品 应经高压蒸汽等消毒处理。4.3 开展非洲猪瘟病毒核酸和抗体检测的实验室，其管理、技术、过程控制和结果质量控制均应符 合 GB/T 27401 要求。4.4 开展非洲猪瘟病毒核酸和抗体检测的实验室，其所从事的检测实验活动种类应达到相应级别的生物 安全实验室防护要求，并取得主管部门的批准。未取得授权或检测资质的实验室不应开展非洲猪瘟检测。 5 样品接收和管理 5.1 样品的包装和运输应符合农业部公告第 503 号的要求，使用密封三层包装，外包装加贴生物危以正式出版文本为准2 SN/T 5335—2020险标识，由专人送达实验室。 5.2 用于非洲猪瘟检测的样品应 2 ℃ ~ 8 ℃冷藏运输，尽快（24h 内）送达实验室。用于病毒核酸或 血清抗体检测的样品，应在 2 ℃ ~ 8 ℃暂存（24 h 内） ，-20℃或 -70℃较长时间保存。需要分离血清 的非抗凝血，室温下放置 12 h~24 h 后收集血清。 用于 PCR 等病毒核酸检测的血液应使用 EDTA 抗凝。组织样品按照农业部公告第 503 号要求采集和送检。样品送样量应达到初筛检测和确诊送样的需要，符合 GB/T 18088 要求。5.3 实验室接收样品时，接样人员应检查外包装有无损坏，确认样品在冷藏和密封状态下运输到实验 室。 如发现包装有破损，应在外层增加密封包装，并立即通知送样人员，评估病毒暴露风险并进行处置。 5.4 在确认样品外包装无破损后，在样品室内打开外包装，检查确认样品内包装无泄漏、无污染， 核对样品种类和数量无误，加贴样品标识。5.5 非洲猪瘟检测样品应实行严格的管理制度，实验室应有专门的冰柜或冰箱用于非洲猪瘟检测样 品的保存，实行“双人双锁”严格管理。如需要调取检测样品时，应经过实验室负责人的同意，并由样品管理员记录。5.6 样品标识应包含但不限于以下信息：样品编号、名称、数量、检测项目。 5.7 用于非洲猪瘟检测的样品不得留样。检测任务完成后，应对检测结果为阴性的样品进行高压蒸 汽消毒（121℃，30 min）或者其它无害化措施处理，并做好处理记录。初筛结果为阳性的样品需要确诊的，按规定包装好送主管部门指定的确诊实验室。 6 样品处理 6.1 样品准备 检验人员负责对样品进行处理和检测。取出样品，待样品解冻后，密封状态下送入实验室生物安 全柜内进行样品制备。 6.2 样品制备要求 在生物安全柜内打开样品包装前，应使用有效消毒剂进行表面消毒，然后进行无菌取样处理。 6.3 样品制备 6.3.1 组织样品制备 应在生物安全柜中用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品 0.1 g~0.2 g 放入无菌研钵或离心管中，再加 入 1 mL~2 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.4，配制见附录 B）后，经充分研磨破碎后制成 10% 组织组织匀 浆液，装于 1.5 mL 灭菌离心管中，12 000 g 离心 5 min 后，取上清，60℃灭活 30 min。如在生物安全柜外利用组织研磨仪处理样品，应将待研磨的样品管表面消毒之后再移出生物安全柜，待研磨结束之后离心，在生物安全柜内取上清，60 ℃作用 30 min 灭活之后用于后续的检测。 6.3.2 抗凝血 在生物安全柜内直接吸取抗凝血分装于 1.5 mL 灭菌离心管中备用。如血液粘稠无法吸取，可用 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）作 10 倍稀释后，吸取抗凝血分装于 1.5 mL 灭菌离心管中。60 ℃灭活 30 min 后移出生物安全柜进行后续的检测。 6.3.3 非抗凝血 非抗凝血样品采集之后，室温下放置 12 h ~ 24 h 待血清析出，在生物安全柜中收集血清，分装于 1.5 mL 灭菌离心管中。如果用于核酸检测，应 60℃灭活 30 min 后移出生物安全柜进行核酸提取；用于以正式出版文本为准3 SN/T 5335—2020免疫学分析的血清，将离心管表面消毒之后方可移出生物安全柜，4 ℃暂存（24 h 以内） ，放在 -20 ℃或 -70℃较长时间保存。免疫学检测过程中可能接触到样品的设备设施应使用有效消毒剂做好消毒处理。 6.3.4 蜱 对蜱进行非洲猪瘟病毒核酸检测，应在生物安全柜中用无菌镊子将蜱样品放入预冷的无菌研钵， 使用 1.5 mL 预冷的 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）研磨，将研磨的匀浆液转入 1.5 mL 灭菌离心管中，1000 g 离心处理 5 min，取上清液 60 ℃灭活 30 min 之后移传出生物安全柜，进行病毒核酸检测或冷冻储存备用。 6.3.5 其它样品 用于非洲猪瘟病毒核酸检测的动物产品、食品、生物制品等其它样品，参照上述组织或液体样 品的处理方法，将待检样品在生物安全柜中灭活处理后进行后续检测活动。 6.4 验余样品暂存 取完样的验余样品用生物安全袋密封包装，做好标记，表面用有效消毒剂表面消毒后，保存 于 -20℃或 -70℃专用冰箱。 7 样品检测 7.1 样品溢洒处理方式 样品检测过程中发生小量液体样品溢洒时，应用吸水纸吸干，然后在表面喷洒有效消毒剂进行 处理。发生大量液体样品溢洒时，应当立即用毛巾或纸巾覆盖感染性物质及相关破碎物品，然后在 上面喷洒有效消毒剂，作用 30 min。对吸水毛巾或纸巾以及破碎物品进行清理（玻璃碎片应用镊子清 理） ，然后再用有效消毒剂喷洒或擦拭污染区域。清理完毕后清洁用具及垃圾应进行高压灭菌。检验 人员整个操作过程应戴手套。 7.2 样品接触皮肤处理方式 当操作样品时溅到或沾到手、脸等皮肤，应立即用 75％酒精或等效的消毒液充分清洗皮肤，或 者用棉球浸湿上述消毒液充分擦拭皮肤，直到清洁干净，然后用清水充分清洗皮肤。如果样品中液体 溅到眼里，则应立即用洗眼器冲洗干净，冲洗眼后的用水应灭菌处理。 7.3 检测方法选择 灭活的样品提取核酸后，实验室可采用标准中推荐的 PCR 或荧光 PCR 等方法开展非洲猪瘟病毒 核酸检测。分离的血清样品如果用于免疫学检测，应注意生物安全。具体操作方法见 OIE《陆生动物 诊断试验和疫苗手册》 （2019 版）3.8.1 节、GB/T 18648 或 SN/T 1559。 8 废弃物及验余样品无害化处理 8.1 非洲猪瘟检测结果为阴性时，验余样品应及时进行高压蒸汽消毒（121℃，30 min）处理，交给 指定的生物安全垃圾处理公司进行无害化处理，并做好记录。 8