以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4656.7 —2020 进出口纺织品生物安全检验方法 第 7 部分：铜绿假单胞菌 Biosafety testing methods of the textiles for import and export — Part 7 ：Pseudomonas aeruginosa 2020 -08-27发布 2021 -03-01 实施ICS 59.080.99 W 09 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准I SN/T 4656.7—2020前 言 SN / T 4656《进出口纺织品生物安全检验方法》 ，共分为以下几个部分： ——第 1 部分：白假丝酵母菌； ——第 2 部分：大肠埃希氏菌； ——第 3 部分：大肠菌群； ——第 4 部分：金黄色葡萄球菌； ——第 5 部分：菌落总数； ——第 6 部分：沙门氏菌； ——第 7 部分：铜绿假单胞菌； ——第 8 部分：通则 …… 本部分为 SN / T 4656 第 7 部分。 本部分按照 GB / T 1.1— 2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国石家庄海关。 本部分主要起草人：李轲、郭会清、禹建鹰、郭华麟、连素梅、徐超、乔晴。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 4656.7—2020进出口纺织品生物安全检验方法 第 7 部分 : 铜绿假单胞菌 1 范围 SN / T 4656 的本部分规定了进出口纺织品中铜绿假单胞菌的检验方法。 本部分适用于进出口纺织品铜绿假单胞菌的检验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB / T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定 SN / T 1538.1 培养基制备指南 第 1 部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN / T 1538.2 培养基制备指南 第 2 部分：培养基性能测试实用指南 SN / T 4656. 8 进出口纺织品生物安全检验方法 第 8 部分：通则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 纺织品生物安全 biosafety of textiles 纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁，及对其所 采取的一系列有效预防和控制措施。 3.2 铜绿假单胞菌 pseudomonas aeruginosa 也称绿脓杆菌，直或微弯革兰氏阴性、需氧、无芽孢杆菌，能够利用乙酰胺作为碳源，并分解 乙酰胺产碱；能还原硝酸盐、液化明胶、在 42 ℃条件下生长良好，具有致死率高、溶血性强、抗药 性强等特性。本菌在自然界分布广泛，主要的生长条件是潮湿环境，其它条件要求不高，可暂时寄生 于皮肤，因此接触性体表感染率相当高。 3.3 环介导恒温扩增 loop-mediated isothermal amplification;LAMP 根据目标菌特有的靶序列保守基因设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的六个 独立区域，利用 Bst DNA 聚合酶启动循环链置换反应，在等温条件下保温 30 min ～60 min 特异、高 效、快速的完成核酸扩增。从 dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的 Mg2+结合，产生副产物 （焦 磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。以正式出版文本为准2 SN/T 4656.7—20204 材料和设备 4.1 无菌剪刀、镊子。 4.2 电子天平：感量 0.01 g。 4.3 无菌均质袋。 4.4 拍击式均质器：400 mL。 4.5 无菌规格板：20 cm2。 4.6 无菌干燥棉拭子。 4.7 微量移液器：量程 0.5 μL ～ 20 μL，量程 100 μL ～ 1 000 μL，量程 1 mL ～ 10 mL。 4.8 无菌小三角瓶：25 mL。 4.9 无菌玻璃平皿或一次性无菌塑料平皿：15 mm×90 mm。 4.10 无菌 L 形玻璃捧。 4.11 恒温培养箱：36 ℃ ±1 ℃、42 ℃ ±1 ℃。 4.12 接种环。 4.13 显微镜：10× ～ 100×。 4.14 全自动微生物生化鉴定系统。 4.15 灭菌离心管：1.5 mL。 4.16 高速冷冻离心机：2 000 r / min ～ 13 000 r / min。 4.17 LAMP 反应管。 4.18 水浴锅：65 ℃ ±1 ℃。 4.19 LAMP 实时浊度仪。 5 培养基和试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；分子检测实验用水符合 GB / T 6682 中一级水的 要求。 5.1 无菌生理盐水：见 A.2。 5.2 SCDLP 液体培养基：见 A.3。 5.3 乙酰胺琼脂：见 A.4。 5.4 革兰氏染色液：见 A.5。 5.5 氧化酶试剂：见 A.6。 5.6 硝酸盐蛋白胨水培养基：见 A.7。 5.7 营养琼脂：见 A.8。 5.8 灭菌双蒸水。 5.9 10×LAMP 扩增缓冲液：含 200 mmol / L Tris- HCl（pH8.8） 、100 mmol / L 硫酸铵、500 mmol / L 氯化钾、20 mmol / L 硫酸镁、1% Tween20。 5.10 引物：根据铜绿假单胞菌的 ETA 基因保守序列，设计一套 LAMP 特异性引物。 外引物 F3 ：5'-TCTTCGGGCAGCTCCG-3' 外引物 B3 ：5'-TGGAGGTTGGCCGAACTC-3' 内引物 FIP ：5'-GCACATCCCGTGGTGCGTG-CAGCGGCGTGGGAGTT-3' 内引物 BIP ：5'-TGGAACGGGGTGGCTTGG-ATAGCGCCCCGAAACCG-3' 环引物 LoopF ：5'-CAAGTGCCCGTATTGCGAC-3' 环引物 LoopB ：5'-ACGGCGGGGCGGGGTGGAG-3'以正式出版文本为准3 SN/T 4656.7—20205.11 100 mmol / L MgSO4。 5.12 10 mmol / L 脱氧核苷三磷酸（dNTP）混合物：每种核苷酸浓度 10 mmol / L。 5.13 Bst DNA 聚合酶 ：8 U / μL。 5.14 显色液：SYBR Green I 染料，1 000×。 5.15 铜绿假单胞菌标准菌株。 6 样品制备 6.1 称量法 无菌方法打开送检样品，用无菌剪刀（4.1）均匀剪样，在电子天平（4.2）上准确称取剪下的 样品 25 g，剪碎后加入到盛有 225 mL 无菌稀释液的无菌均质袋 (4.3) 中，用拍击式均质器 (4.4) 拍打 1 min ～ 2 min，充分混匀，得到一个 1:10 的样品匀液。 6.2 多点采样洗脱法 无菌方法打开送检样品，在样品四周和中间均匀布控 5 个采样点，用无菌规格板（4.5）按每个 采样点按 4 cm×5 cm（20 cm2）面积范围剪裁，每 20 cm2采样面积为 1 份检样，每件样品共采集 5 份 检样 , 采样面积为 100 cm2。 将上述采集好的 5 份检样放入盛有 200 mL 无菌稀释液的无菌均质袋 (4.3) 中， 用拍击式均质器 (4.4) 拍打 1 min ～ 2 min，充分混匀，制成的样品匀液作为原液。 6.3 棉拭子涂抹法 无菌方法打开送检样品，用无菌稀释液湿润无菌干燥棉拭子（4.6） ，在样品四周和中间均匀布控 5 个采样点，用无菌规格板（4.5）比照按每个采样点 20 cm2面积范围均匀涂抹，每个采样点用 1 个 无菌干燥棉拭子（4.6） ，在 4 cm×5 cm（20 cm2）面积范围均匀涂抹，立即用无菌剪刀（4.1）剪去棉 拭子手接触部分，将涂抹部分一块放入盛有 50 mL 无菌稀释液的无菌均质袋（4.3） 中混匀，制成 1:10 的样品匀液。 6.4 样品制备方法的选择 6.4.1 样品制备一般依 6.1 方法为基准方法。 6.4.2 当样品为面积较大或较厚实或多孔时，样品制备应采用 6.2 方法。采用 6.2 方法时如果被检样品 面积过大或过小，采样点可按比例增加或减少。 6.4.3 当样品质地致密，不容易剪碎制备；或样品较贵重，客户要求无损检测的，样品制备应采用 6.3 方法。 6.4.4 采用 6.1、6.2 方法时如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样品匀液转种时，稀释液可适 当增加直至足够吸出转种。 7 方法一 铜绿假单胞菌定量检验方法 平板计数法 7.1 原理 铜绿假单胞菌具有乙酰胺酶 , 能利用乙酰胺作为碳源，并分解乙酰胺产碱。样品接种乙酰胺培养 基后，目标菌能使乙酞胺培养基变红；结合铜绿假单胞菌具有氧化酶阳性、能使硝酸盐还原产气和在 42 ℃生长的特性，准确判定铜绿假单胞菌。 7.2 检验程序 检验程序见图 1。以正式出版文本为准4 SN/T 4656.7—202024h±2h 36℃±1℃10倍系列稀释按6.1、6.2、6.3制备的生理盐水样品匀液 42生长试验无可疑菌落 结果报告硝酸盐还原产气试验 氧化酶