书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ ６ ５ ６．３—２ ０ １ ６ 进出口纺织品生物安全检验方法第３部分：大肠菌群 犅 犻 狅 狊 犪 犳 犲 狋狔狋 犲 狊 狋 犻 狀犵犿 犲 狋 犺 狅 犱 狊狅 犳 狋 犺 犲狋 犲 狓 狋 犻 犾 犲 狊犳 狅 狉 犻 犿 狆狅 狉 狋犪 狀 犱犲 狓 狆狅 狉 狋—犘 犪 狉 狋３：犆 狅 犾 犻 犳 狅 狉 犿 ２ ０ １ ６１ ２１ ２发布 ２ ０ １ ７０ ７０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　Ｓ Ｎ／Ｔ４ ６ ５ ６《进出口纺织品生物安全检验方法 》共分为５部分： — — —第１部分：白假丝酵母菌 ； — — —第２部分：大肠埃希氏菌 ； — — —第３部分：大肠菌群 ； — — —第４部分：金黄色葡萄球菌 ； — — —第５部分：菌落总数 。本部分为 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ６ ５ ６的第３部分。本部分按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本部分起草单位 ：中华人民共和国河南出入境检验检疫局 、四川农业大学 。本部分主要起草人 ：郭会清、李轲、徐超、禹建鹰、郭华麟、苗丽、乔晴、王永杰、杨娜、白杰。 Ⅰ犛 犖／犜４ ６ ５ ６．３—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.进出口纺织品生物安全检验方法第３部分：大肠菌群 １　范围 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ６ ５ ６的本部分规定了进出口纺织品中大肠菌群的定性 、定量检验方法 。 本部分适用于进出口纺织品大肠菌群检验 。其他纺织类产品可参考使用本部分 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ８ １ ７ ０　数值修约规则与极限数值的表示和判定 Ｓ Ｎ／Ｔ１ ５ ３ ８． １ 　培养基制备指南 　第１部分：实验室培养基制备质量保证通则 Ｓ Ｎ／Ｔ１ ５ ３ ８． ２ 　培养基制备指南 　第２部分：培养基性能测试实用指南 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３．１纺织品生物安全 　犫 犻 狅 狊 犪 犳 犲 狋狔狅 犳 狋 犲 狓 狋 犻 犾 犲 狊纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁 ，及对其所采 取的一系列有效预防和控制措施 。 ３．２大肠菌群 　犮 狅 犾 犻 犳 狅 狉 犿需氧及兼性厌氧 ，能在３ ７℃４ ８ｈ 分解乳糖产酸产气的一群革兰氏阴性无芽孢杆菌 。 ４　环境、设备和材料 ４．１　常规微生物检测用的基本设备与材料 。 ４．２　无菌剪刀 、镊子。 ４．３　电子天平 ：０． ０ １ｇ。 ４．４　全滤网无菌均质袋 。 ４．５　拍击式均质器 ：４ ０ ０ｍＬ 。 ４．６　无菌规格板 ：２ ０ｃ ｍ２。 ４．７　无菌干燥棉拭子 。 ４．８　微量移液器 ：２ ０ ０μＬ～１０ ０ ０μＬ、１ｍＬ～１ ０ｍＬ。 ４．９　无菌小三角瓶 ：２ ５ｍＬ。 ４．１ ０　无菌吸头 ：１０ ０ ０μＬ、１ ０ｍＬ。 １犛 犖／犜４ ６ ５ ６．３—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.４．１ １　无菌玻璃平皿或塑料平皿 ：１ ５ｍｍ×９ ０ｍｍ 。 ４．１ ２　恒温水浴箱 ：４ ５℃±１℃ 。 ４．１ ３　恒温培养箱 ：３ ６℃±１℃ 。 ４．１ ４　放大镜（放大５倍～１ ０倍）或菌落计数器 。 ４．１ ５　滤膜或一次性无菌滤膜 ：直径４ ７ｍｍ，微孔径０． ４ ５μｍ。 ４．１ ６　烧杯：５ ０ ０ｍＬ 。 ４．１ ７　无菌滤器 。 ４．１ ８　抽滤设备 。 ４．１ ９　接种环。 ４．２ ０　无菌三角瓶 ：３ ０ ０ｍＬ 。 ５　培养基、试剂 ５．１　磷酸盐缓冲液 ：见Ａ． ２。 ５．２　无菌生理盐水 ：见Ａ． ３。 ５．３　结晶紫中性红胆盐琼脂 （ＶＲ ＢＡ） ：见Ａ． ４。 ５．４　煌绿乳糖胆盐肉汤 （Ｂ Ｇ Ｌ Ｂ肉汤）发酵管：见Ａ． ５。 ５．５　Ａ ｌ ｉ ｚ ｇａ ｌ琼脂：见Ａ． ６。 ５．６　月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 （Ｌ Ｓ Ｔ肉汤）发酵管：见Ａ． ７。 注：本部分中无菌稀释液均为磷酸盐缓冲液 （５． １）或无菌生理盐水 （５． ２） 。 ６　样品制备 ６．１　称量法 无菌方法打开送检的样品 ，用无菌剪刀 （４． ２）均匀剪样 ，在电子天平 （４． ３）上准确称取剪下的样品 ２ ５ｇ样品。剪碎后加入到盛有 ２ ２ ５ｍＬ 无菌稀释液的全滤网无菌均质袋 （４． ４）中，用拍击式均质器 （４． ５） 拍打１ｍ ｉ ｎ～２ｍ ｉ ｎ，充分混匀 ，得到一个 １∶１ ０的样品匀液 。 ６．２　多点采样洗脱法 无菌方法打开送检的样品 ，在样品四周和中间均匀布控 ５个采样点 ，用无菌规格板 （４． ６）按每个采样点２ ０ｃ ｍ２面积范围剪裁 ，每２ ０平方厘米采样面积为 １份检样，每个样品共采集 ５份检样，采样面积为 １ ０ ０ｃ ｍ２。将上述采集好的 ５份检样放入盛有 ２ ０ ０ｍＬ 无菌稀释液的全滤网无菌均质袋 （４． ４）中，用拍击式均质器 （４． ５）拍打１ｍ ｉ ｎ～２ｍ ｉ ｎ，充分混匀 ，得到一个洗脱液 ，制成样品匀液作为原液 。 ６．３　棉拭子涂抹法 无菌操作方法打开送检的样品 ，用无菌稀释液湿润无菌干燥棉拭子 （４． ７） ，在样品四周和中间均匀布控５个采样点 ，用无菌规格板 （４． ６）比照按每个采样点 ２ ０ｃ ｍ２面积范围均匀涂抹 ，每个采样点用 １个无菌干燥棉拭子 （４． ７） ，立即用无菌剪刀 （４． ２）剪去棉拭子手接触部分 ，将涂抹部分一块放入盛有 ５ ０ｍＬ无菌稀释液的全滤网无菌均质袋 （４． ４）中，制成１∶１ ０的样品匀液 。 ６．４　样品制备方法的选择 样品制备一般依 ６． １方法２ ５ｇ样品＋２ ２ ５ｍＬ 稀释液为基准方法 ，但当样品为面积较大或较厚实或 ２犛 犖／犜４ ６ ５ ６．３—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.多孔时，样品制备应采用 ６． ２方法。当出现以下情况时 ：ａ）样品质地致密不容易剪碎制备 ；ｂ）样品较贵 重，客户要求无损检测的 ，样品制备应采用 ６． ３方法。采用６． １、６． ２方法时如果被检样品大量吸水而导 致不能吸出足够样液时 ，稀释液量可按整数倍递增 ，直至能有足够的测试样液 。采用６． ２方法时如果被 检样品面积过大或过小 ，采样点可按比例增加或减少 。 ７　大肠菌群定量检验方法 　平板计数法 ７．１　原理 大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸 ，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫黑色 、带或不带 有金属光泽的特定形态菌落 。 ７．２　检验程序 检验程序见图 １。 图１　大肠菌群平板计数法检验程序 ７．３　操作步骤 ７．３．１　样液稀释 用微量移液器 （４． ８）移取制备好的样品匀液 １ｍＬ，缓慢注于盛有 ９ｍＬ稀释液的无菌小三角瓶 （４． ９）中（注意吸头尖端不要触及稀释液液面 ） ，振摇小三角瓶 （４． ９）或换用１支无菌吸头 （４． １ ０）反复吹打 使其混合均匀 ，制成下一稀释度的样品匀液 。按照以上操作程序 ，制备１ ０倍系列稀释样品匀液 。每递 增稀释１次，换用１次无菌吸头 （４． １ ０） 。 ３犛 犖／犜４ ６ ５ ６．３—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.７．３．２　样品接种 ７．３．２．１　检测时应根据样品的实际污染情况 ，选择２个～３个合适稀释度样品匀液 （包括原液 ） ，在进行 １ ０倍递增稀释时 ，同时吸取 １ｍＬ样品匀液于无菌平皿 （４． １ １）内，每个稀释度接种两个平皿 。同时分别 吸取１ｍＬ空白稀释液加入两个无菌平皿 （４． １ １）内做空白对照 。 ７．３．２．２　及时将１ ５ｍＬ～２ ０ｍＬ冷却至４ ５℃的结晶紫中性红胆盐琼脂 （ＶＲ Ｂ Ａ） （５． ３） ［可放置４ ５℃±１℃水浴箱（４． １ ２）中保温］倾注平皿 ，边倾注边轻转动平皿使其混合均匀 。 ７．３．３　培养 待琼脂凝固后 ，将平板翻转 ，倒置放入培养箱 （４． １ ３） ，３ ６℃±１℃ 培养２ ４ｈ±２ｈ 。 ７．３．４　典型菌落计数和确认 ７．３．４．１　培养结束时应及时计数 。可用肉眼观察 ，必要时用放大镜或菌落计数器 （４． １ ４） 。菌落计数以 菌落形成单位 （ｃ ｏ ｌ ｏ ｎｙ ｆ ｏ ｒ ｍ ｉ ｎｇｕ ｎ ｉ ｔ ｓ，Ｃ ＦＵ）表示。 ７．３．４．２　大肠菌群在结晶紫中性红胆盐琼脂 （ＶＲ ＢＡ） （５． ３）平板上呈紫红色菌落 ，菌落周围有红色胆盐 沉淀环，菌落较大 ，直径约０． ５ｍｍ 。 ７．３．４．３　选择有典型或可疑大肠菌群菌落平板计数 ，计数合适范围为 １ ５Ｃ ＦＵ ～１ ５ ０Ｃ ＦＵ ，原则上尽可 能选择典型或可疑菌落数在合适的计数范围或接近合适的计数范围的平板 ，计数典型或可疑菌落数 ，每 个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数 。如果： ａ）　只有一个稀释度两个平板的典型或可疑菌落数在 １ ５Ｃ ＦＵ ～１ ５ ０Ｃ ＦＵ 之间，计数该稀释度两 个平板上的典型或可疑菌落 。 ｂ）最低稀释度两个平板的典型或可