书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ ６ ５ ６．１—２ ０ １ ６ 进出口纺织品生物安全检验方法第１部分：白假丝酵母菌 犅 犻 狅 狊 犪 犳 犲 狋狔狋 犲 狊 狋 犻 狀犵犿 犲 狋 犺 狅 犱 狊狅 犳 狋 犺 犲狋 犲 狓 狋 犻 犾 犲 狊犳 狅 狉 犻 犿 狆狅 狉 狋犪 狀 犱犲 狓 狆狅 狉 狋—犘 犪 狉 狋１：犆 犪 狀 犱 犻 犱 犪犪 犾 犫 犻 犮 犪 狀 狊 ２ ０ １ ６１ ２１ ２发布 ２ ０ １ ７０ ７０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　Ｓ Ｎ／Ｔ４ ６ ５ ６《进出口纺织品生物安全检验方法 》共分为５部分： — — —第１部分：白假丝酵母菌 ； — — —第２部分：大肠埃希氏菌 ； — — —第３部分：大肠菌群 ； — — —第４部分：金黄色葡萄球菌 ； — — —第５部分：菌落总数 。本部分为 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ６ ５ ６的第１部分。本部分按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本部分起草单位 ：中华人民共和国河南出入境检验检疫局 、四川农业大学 。本部分主要起草人 ：李轲、郭会清、乔晴、禹建鹰、郭华麟、苗丽、徐超、杨娜、王永杰。 Ⅰ犛 犖／犜４ ６ ５ ６．１—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.进出口纺织品生物安全检验方法第１部分：白假丝酵母菌 １　范围 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ６ ５ ６的本部分规定了进出口纺织品中白假丝酵母菌的定性 、定量检验方法 。本部分适用于进出口纺织品白假丝酵母菌的检验 。其他纺织类产品可参考使用本部分 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ８ １ ７ ０　数值修约规则与极限数值的表示和判定 Ｓ Ｎ／Ｔ１ ５ ３ ８． １ 　培养基制备指南 　第１部分：实验室培养基制备质量保证通则 Ｓ Ｎ／Ｔ１ ５ ３ ８． ２ 　培养基制备指南 　第２部分：培养基性能测试实用指南 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３．１纺织品生物安全 　犫 犻 狅 狊 犪 犳 犲 狋狔狅 犳 狋 犲 狓 狋 犻 犾 犲 狊纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁 ，及对其所采取的一系列有效预防和控制措施 。 ３．２白假丝酵母菌 　犆．犪 犾 犫 犻 犮 犪 狀 狊一种真菌 ，也叫白色念珠菌 ，细胞呈圆形或卵圆形 ，直径３μｍ～６μｍ，出芽繁殖 ，主要特征表现为可形成假菌丝 、芽管和厚膜孢子 ，不产生囊孢子 、掷孢子、关节孢子 ，不能利用肌醇做为碳源 ，大多数菌种需氧，主要寄生在人体的体表及口腔咽喉 、呼吸道、肠道、阴道黏膜上 ，当机体免疫力下降时 ，易引起局部甚至系统性感染 。 ４　设备与材料 ４．１　常规微生物检测用的基本设备与材料 。 ４．２　无菌剪刀 。 ４．３　电子天平 ：０． ０ １ｇ。 ４．４　全滤网无菌均质袋 。 ４．５　拍击式均质器 ：４ ０ ０ｍＬ 。 ４．６　无菌规格板 ：２ ０ｃ ｍ２。 ４．７　无菌干燥棉拭子 。 ４．８　恒温培养箱 ：２ ８℃±１℃ 、４ ５℃±１℃ 。 １犛 犖／犜４ ６ ５ ６．１—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.４．９　接种环。 ４．１ ０　麦氏比浊管 。 ４．１ １　微量移液器 ：２ ０μＬ～２ ０ ０μＬ、２ ０ ０μＬ～１０ ０ ０μＬ、１ｍＬ～５ｍＬ。 ４．１ ２　无菌试管 ：１ ０ｍｍ×１ ０ ０ｍｍ 。 ４．１ ３　恒温水浴箱 ：４ ５℃±１℃ 、３ ６℃±１℃ 。 ４．１ ４　载玻片。 ４．１ ５　盖玻片。 ４．１ ６　显微镜：１ ０×～１ ０ ０×。 ４．１ ７　无菌小三角瓶 ：２ ５ｍＬ。 ４．１ ８　无菌吸头 ：２ ０ ０μＬ、１０ ０ ０μＬ、５ｍＬ。 ４．１ ９　无菌玻璃平皿或一次性无菌塑料平皿 ：１ ５ｍｍ×９ ０ｍｍ 。 ４．２ ０　放大镜（放大５倍～１ ０倍）或菌落计数器 。 ５　培养基、试剂 ５．１　无菌生理盐水 ：见Ａ． ２。 ５．２　麦芽浸膏肉汤 （ＭＥ Ｂ肉汤） ：见Ａ． ３。 ５．３　念珠菌显色培养基 ：见Ａ． ４。 ５．４　Ｃ ａ ｎ ｄ ｉ ｄ ａＥ ｌ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ 琼脂：见Ａ． ５。 ５．５　１％吐温８ ０ 玉米琼脂培养基 ：见Ａ． ６。 ５．６　兔血清：见Ａ． ７。 ５．７　革兰氏染色液 ：见Ａ． ８。 注：本部分中无菌稀释液均为无菌生理盐水 （５． １）或麦芽浸膏肉汤 （５． ２） 。 ６　样品制备 ６．１　称量法 无菌方法打开送检的样品 ，用无菌剪刀 （４． ２）均匀剪样 ，在电子天平 （４． ３）上准确称取剪下的样品 ２ ５ｇ样品。剪碎后加入到盛有 ２ ２ ５ｍＬ 无菌稀释液的全滤网无菌均质袋 （４． ４）中，用拍击式均质器 （４． ５）拍打１ｍ ｉ ｎ～２ｍ ｉ ｎ，充分混匀 ，得到一个 １∶１ ０的样品匀液 。 ６．２　多点采样洗脱法 无菌方法打开送检的样品 ，在样品四周和中间均匀布控 ５个采样点 ，用无菌规格板 （４． ６）按每个采 样点２ ０ｃ ｍ２面积范围剪裁 ，每２ ０ｃ ｍ２采样面积为 １份检样，每个样品共采集 ５份检样，采样面积为 １ ０ ０ｃ ｍ２。将上述采集好的 ５份检样放入盛有 ２ ０ ０ｍＬ 无菌稀释液的全滤网无菌均质袋 （４． ４）中，用拍击 式均质器 （４． ５）拍打１ｍ ｉ ｎ～２ｍ ｉ ｎ，充分混匀 ，得到一个洗脱液 ，制成样品匀液作为原液 。 ６．３　棉拭子涂抹法 无菌操作方法打开送检的样品 ，用无菌稀释液湿润无菌干燥的棉拭子 （４． ７） ，在样品四周和中间均 匀布控５个采样点 ，用无菌规格板 （４． ６）比照按每个采样点 ２ ０ｃ ｍ２面积范围均匀涂抹 ，每个采样点用 １个无菌干燥棉拭子 （４． ７） ，立即用无菌剪刀 （４． ２）剪去棉拭子手接触部分 ，将涂抹部分一块放入盛有 ５ ０ｍＬ无菌稀释液的全滤网无菌均质袋 （４． ４）中，制成１∶１ ０的样品匀液 。 ２犛 犖／犜４ ６ ５ ６．１—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.６．４　样品制备方法的选择 样品制备一般依 ６． １方法２ ５ｇ样品＋２ ２ ５ｍＬ 无菌稀释液为基准方法 ，但当样品为面积较大或较厚实或多孔时 ，样品制备应采用 ６． ２方法。当出现以下情况时 ：ａ）样品质地致密不容易剪碎制备 ；ｂ）样品较贵重，客户要求无损检测的 ，样品制备应采用 ６． ３方法。采用６． １、６． ２方法时如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样品匀液时 ，稀释液量可按整数倍递增 ，直至能有足够的测试样品匀液 。采用６． ２方法时如果被检样品面积过大或过小 ，采样点可按比例增加或减少 。 ７　白假丝酵母菌定性检验方法 ７．１　原理 根据白假丝酵母菌致病株 （菌丝相菌株才有致病能力 ）形态特征和生理生化特性 ，选用改良的选择性培养基 ，经过传统培养分纯菌株 ，观察芽管 、菌丝、假菌丝、厚膜孢子形成 ，根据白假丝酵母菌 ４ ５℃生长的特点 ，鉴定白假丝酵母菌 。 ７．２　检验程序 检验程序见图 １。 图１　白假丝酵母菌定性检验程序 ７．３　操作步骤 ７．３．１　增菌 如按６． １制备样品 ，则称取２ ５ｇ样品，剪碎后加入到盛有 ２ ２ ５ｍＬ 麦芽浸膏肉汤 （５． ２）的全滤网无菌均质袋（４． ４）内均质；如按６． ２制备样品 ，将６． ２采集好的 ５份检样放入盛有 ２ ０ ０ｍＬ 麦芽浸膏肉汤 （５． ２） ３犛 犖／犜４ ６ ５ ６．１—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.的全滤网无菌均质袋 （４． ４）内均质；如按６． ３制备样品 ，则将棉拭子涂抹部分一块放入盛有 ５ ０ｍＬ麦芽浸膏肉汤 （５． ２）的全滤网无菌均质袋 （４． ４）内混匀，样品制备好后均放入 ２ ８℃±１℃ 恒温培养箱 （４． ８）增菌培养４ ８ｈ±２ｈ 。 ７．３．２　分离 将培养后的增菌液接种念珠菌显色培养基 （５． ３）平板和Ｃ ａ ｎ ｄ ｉ ｄ ａＥ ｌ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ 琼脂（５． ４）平板，２ ８℃±１℃培养４ ８ｈ±２ｈ ，观察菌落形态 。白假丝酵母菌在念珠菌显色培养基 （５． ３）上菌落形态参照其说明书观察。白假丝酵母菌在 Ｃ ａ ｎ ｄ ｉ ｄ ａＥ ｌ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ 琼脂（５． ４）平板上呈深棕色小菌落 ，圆形凸起 ，边缘整齐 ，表面干燥成磨砂样 ，用无菌接种环 （４． ９）接触后有类似巧克力融化后的样子 。如培养５ ０ｈ后两种平板上均无典型或可疑菌落生长 ，则可直接报告白假丝酵母菌未检出 。从有典型或可疑菌落的各类平板上至少挑取５个（少于５个全部挑取 ）典型或可疑菌落进行如下确证试验 。 ７．３．３　确证试验 ７．３．３．１　菌落纯化 用无菌接种环 （４． ９）挑取上述平板上典型或可疑单个菌落分别接种到两个 １％吐温８ ０ 玉米琼脂培养基（５． ５）平板上，２ ８℃±１℃ 培养４ ８ｈ±２ｈ ，分离纯化 。 ７．３．３．２　芽管试验 取１％吐温８ ０ 玉米