ICS 65.080 B 10 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 1109—2017 代替NY 1109—2006 微生物肥料生物安全通用技术准则 General biosafety standard for microbial fertilizers 2017-12-22 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 1109—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替NY1109—2006《微生物肥料生物安全通用技术准则》。与NY1109—2006相比，除编 辑性修改外主要技术变化如下： 修改了半数致死量（LDso）定义； 修改了溶血试验的质控菌株要求； -修改了菌种安全分级目录； 一增加了急性经口毒性定义； 一增加了生产用菌种需做溶血试验的要求； 一增加了植物病原菌不可用作生产菌种的要求； 一删除了引用标准GB/T4789.28。 本标准由农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：农业部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心、农业部微生物产品质量 安全风险评估实验室（北京）、中国农业科学院农业资源与农业区划研究所。 本标准主要起草人：姜昕、李俊、曹凤明、马鸣超、关大伟、李力、葛一凡、杨小红、冯瑞华。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： -NY 1109—2006。 I NY/T 1109—2017 微生物肥料生物安全通用技术准则 1范围 本标准规定了微生物肥料生产用菌种安全性分级目录、不同菌种及产品选择毒理学试验的原则、程 序、试验方法和结果评价方法。 本标准适用于中华人民共和国境内生产、销售的微生物肥料。 2规范性引用文件 于本文件 GB 15193.3 食品安全国家标准 性经口 3术语和定义 RESE 文件 3. 1 S 急性经口毒性 acut oral toxicity 次或在24 h内多 经口给予实验动物受试物后 动物在短期内出现的 A 3. 2 R 半数致死量 经口- 24h内 够引起动 物死亡率为50%的受 式物剂 核剂量为经过 统计得出的 值。 数或克数表 为毫 千克（mg/kg） 或克每千克(g/ 4选择毒理学试验的原贝 4.1生产用菌 GRI 种 4.1.1总则 微生物肥料生产用菌种分 四级管理 分级目录见附录A 得菌种应经专业权威 机构鉴定。未列入附录 A 中的菌种,除根瘤菌和乳杆菌(Lactobacillus)外 均需做毒理学试验。所 有生产用菌种均需要做溶血 Ⅱ试验,植物病原菌不可用作生产菌种。采用生 工程菌，应具有允许大面积 释放的生物安全性有关批文。 4.1.2菌种安全分级 4.1.2.1第一级(A.1)为免做毒理学试验的菌种。 4. 1.2. 2 2第二级(A.2)为需做急性经口毒性试验的菌种。 4. 1.2. 3 3第三级(A.3)为需做致病性试验的菌种。 4.1.2.4第四级(A.4)为禁用菌种。 4.2产品 4.2.1除有机物料腐熟剂以外的固体微生物接种剂类产品均免做毒理学试验。 4. 2. 2 复合微生物肥料、生物有机肥和液体剂型微生物接种剂等需做急性经口毒性试验。 1 NY/T 1109—2017 5毒理学试验程序 5.1菌种毒理学试验程序 5.1.1应提供微生物肥料生产用菌种的鉴定资料，包括属及种的拉丁学名和中文译名、形态、生理生 化特性及鉴定依据、功能评价等资料。 5.1.2根据产品所含菌种的鉴定资料，按照附录A的规定，确定菌种安全级别、是否做毒理学试验及 毒理学检测项目。 5. 1.3对于需要做毒理学试验的菌种,生产者需提供试验用纯菌种斜面,经复核确认与该菌种鉴定资 料相符且无杂菌污染后,进行毒理学试验。 5.2产品毒理学程序 需对送检产品进行质量检测和载体物料的真实性确认后，进行毒理学试验。 6试验方法 6.1受试物的准备 6.1.1菌种受试物 将试验菌种接种于适宜的培养基中,在适宜的条件下培养一定时间,用生理盐水调整菌液浓度至 2. 0 ×10° CFU/mL~2. 0 ×10° CFU/mL,该溶液为菌种受试物。 6.1.2产品受试物 固体产品根据试验要求，配制所需浓度，溶剂首选去离子水，也可选用羧甲基纤维素、明胶、淀粉等。 液体产品不可稀释，直接使用。 6.2急性经口毒性试验 按GB15193.3的规定执行。 6.3致病性试验项目 6.3.1急性经口毒性试验 按GB15193.3的规定执行。 6.3.2一次破损皮肤刺激试验 6.3.2.1目的 检测受试物对实验动物皮肤的刺激/腐蚀作用和强度。 6.3.2.2实验动物 每次实验至少需要3只皮肤完好的白色健康家兔或豚鼠。 6.3.2.3操作程序 6.3.2.3.1涂受试物前,将实验动物背部脊柱两侧的毛去掉,去毛范围约 2.5 cm×2.5 cm,用 75% 酒 精清洁、消毒暴露皮肤,待酒精挥发后,用灭菌刀片或注射针头分别在两块皮区内划一个“#”形的破损 伤口。注意皮肤破损仅达表皮,不要伤及真皮。 6.3.2.3.2将受试物0.5mL直接滴于破损皮肤上,或滴于同样大小的2层~4层纱布上并敷贴于破 损皮肤表面,然后用一层无刺激塑料膜或油纸覆盖,再用无刺激胶布固定。另一侧去毛破损皮肤作为空 白对照（或溶剂对照）,敷贴时间为4h。试验结束后,用温水或无刺激性溶剂除去残留受试物。 6.3.2.3.3分别于去除受试物后1h、24h和48h观察皮肤局部反应,并按表1进行刺激反应评分。 注意鉴别感染和原发性刺激反应的区别,若有感染可疑,应进行重复测试。 6.3.2.4评价规定 在各个观察时间点,按照表1对动物的皮肤红斑与水肿形成情况进行评分,并按时间点将3只动物 2 NY/T 1109—2017 的评分相加,除以动物数,获得不同时间点的皮肤刺激反应积分均值（刺激指数）。取其中最高皮肤刺 激指数,按表2评定该受试物对动物皮肤刺激强度的级别。 表1 皮肤刺激反应的评分标准 皮肤刺激反应 皮肤刺激反应评分 红斑形成： 无 0 勉强可见 1 明显红斑 2 中等至严重红斑 3 紫红色红斑并有焦痴形成 4 水肿形成： 无 0 PUBL 勉强可见 1 皮肤隆起,轮廓清楚 水肿隆起不超过 水肿隆起超过1 RE 皮肤刺激强 肤刺 激指数 创激理摩级 0-0 5（不含） 无刺激性 0.5 2.0（不含） 6.0（不含） R 0~8.0 CH 6.3.3溶血试验 6. 3. 3. 1 目的 CEr 检测受试物 是否具有溶血特性 6.3.3.2操作程 用无菌棉拭 蘸取菌种受试 36 C培养 箱 中培养，（24±2） h 后观察有无溶血 阳性 38~蜡村 芽孢杆菌CMCC(B) ER 63303等作为质控 蘭 朱 6.3.3.3试验结果 菌落周围有β溶血环或α溶血环的,则溶血试验阳性 否则为阴性 6.3.4抗菌药物敏感试验 6.3.4.1目的 检测受试物对抗菌药物的敏感 6.3.4.2试验用抗菌药物 可选用头孢酮（CFP）、四环素（TE）、头孢唑啉（CZ）、链霉素（S）、痢特灵（FR）、环丙沙星（CIP）、 （O）（）（））（S) （AN）、甲氟哌酸（PEF）、氟啶酸（ENO）、多西环素（DO）、依诺沙星（ENO）、阿米卡星（AN）、黄连素（Ber- berine hydrochloride）、两性霉素B（Amphotericin B）、伊曲康唑（Itraconazole）等抗菌药物。 6.3.4.3操作程序 6.3.4.3.1用无菌棉拭子将受试物均匀涂抹于营养琼脂平板表面,共3次。每涂抹1次,平板应转动 60°,最后将棉拭子绕平板边缘涂抹1周。盖好平血,置室温干燥5min。 3 NY/T 1109—2017 6.3.4.3.2用无菌棉拭子蘸取浓度为2.0×108CFU/mL~2.0×10°CFU/mL质控菌株菌悬液,均匀 涂抹于营养琼脂平板表面,具体方法同6.3.4.3.1,作为对照试验。 6.3.4.3.3以无菌操作取出抗菌药物纸片分别贴在涂有受试物和质控菌株菌悬液的平板培养基表 面,每个平板放4个纸片。然后将平板置于(36±1)℃恒温培养箱中培养18h后观察抗菌药物纸片周 围有无抑菌环,量取并记录其直径（包括纸片直径）大小,单位为毫米（mm）。试验应做3个平行,取其 均值。 6.3.4.3.4质控菌抑菌环应均在质控范围内，说明试验方法准确可靠，否则试验无效。质控菌株可选 用大肠埃希氏菌ATCC25922等标准菌株。 6.3.5急性腹腔注射致病性试验 6.3.5.1目的 检测受试物的急性致病性。 6.3.5.2试验动物 清洁级健康成年昆明小鼠（Kunmingmice）或BALB/c小鼠（BALB/cmice）。 6.3.5.3操作程序 选健康成年小鼠40只,体重18g~20g,雌、雄各半,剂量为500mg/kg,按0.1mL/10g经腹腔注射 受试物。 于腹腔注射后第3d、第7d分别取存活的实验动物雌、雄各5只解剖,并做大体病理学观察。 腹腔注射后第14d将剩余实验动物处死、解剖并做大体病理学观察。 6.3.5.4结果观察、评价 根据试验周期内动物有无死亡及出现的中毒体征、大体病理学观察及病理组织学检查发现病变的 程度进行分级判定（见表3）。 表3急性致病性判定标准 级别 判定依据 动物出现死亡,死亡动物及24h以上存活动物在第3d、第7d经解剖肉眼检 强致病性 查和病理组织学检查即可发现脏器的明显病变 动物有中毒体征无死亡,动物第14d经解剖肉眼检查和病理组织学检查可发 弱致病性 现脏器的明显病变 动物无中毒体征无死亡,动物第14d经解剖肉眼检查和病理组织学检查均未 无致病性 发现脏器的明显病变