ICS65.100 B13 中华人民共和国国家标准 GB/T31270.16—2014 化 化学农药环境安全评价试验准则 第16部分:土壤微生物毒性试验 Testguidelinesonenvironmentalsafetyassessmentforchemicalpesticides— Part16:Soilmicroorganismtoxicitytest 2014-10-10发布 2015-03-11实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 GB/T31270《化学农药环境安全评价试验准则》分为21个部分: ———第1部分:土壤降解试验; ———第2部分:水解试验; ———第3部分:光解试验; ———第4部分:土壤吸附/解吸试验; ———第5部分:土壤淋溶试验; ———第6部分:挥发性试验; ———第7部分:生物富集试验; ———第8部分:水-沉积物系统降解试验; ———第9部分:鸟类急性毒性试验; ———第10部分:蜜蜂急性毒性试验; ———第11部分:家蚕急性毒性试验; ———第12部分:鱼类急性毒性试验; ———第13部分:溞类急性活动抑制试验; ———第14部分:藻类生长抑制试验; ———第15部分:蚯蚓急性毒性试验; ———第16部分:土壤微生物毒性试验; ———第17部分:天敌赤眼蜂急性毒性试验; ———第18部分:天敌两栖类急性毒性试验; ———第19部分:非靶标植物影响试验; ———第20部分:家畜短期饲喂毒性试验; ———第21部分:大型甲壳类生物毒性试验。 本部分是GB/T31270的第16部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由中华人民共和国农业部提出并归口。 本部分负责起草单位:农业部农药检定所、环保部南京环境科学研究所。 本部分主要起草人:程燕、范继巧、王娜、韩志华、赵玉艳、王彦华、李少男、蔡道基。 ⅠGB/T31270.16—2014 化学农药环境安全评价试验准则 第16部分:土壤微生物毒性试验 1 范围 GB/T31270的本部分规定了CO2吸收法和氮转化法测定化学农药对土壤微生物毒性的材料、条 件、操作、质量控制、数据处理、试验报告等的基本要求。 本部分适用于为化学农药登记而进行的土壤微生物毒性试验,其他类型的农药可参照使用。 本部分不适用于易挥发和难溶解的化学农药。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 化学农药 chemicalpesticide 利用化学物质人工合成的农药。其中有些以天然产品中的活性物质为母体,进行仿制、结构改造, 创新而成,为仿生合成农药。 同义词:有机合成农药syntheticorganicpesticide。 [NY/T1667.1—2008,定义2.2.1] 2.2 原药 technicalmaterial 在制造过程中得到的有效成分及杂质组成的最终产品,不能含有可见的外来物质和任何添加物,必 要时可加入少量的稳定剂。 [NY/T1667.2—2008,定义2.5.1] 2.3 制剂 formulationproduct 由农药原药(或母药)和助剂组成、使用状态稳定的产品。 [NY/T1667.2—2008,定义2.4] 2.4 有效成分 activeingredient;a.i. 农药产品中具有生物活性的特定化学结构成分。 [NY/T1667.2—2008,定义2.1] 2.5 供试物 testsubstance 试验中需要测试的物质。 2.6 影响率 effectratio 供试物对土壤微生物呼吸强度的影响程度,包括抑制率和促进率。供试物处理土壤呼吸强度低于 对照土壤时,表现为抑制,供试物处理土壤呼吸强度高于对照土壤时,表现为促进。 1GB/T31270.16—2014 2.7 氮转化 nitrogentransformation 微生物通过氨化和硝化作用,将含氮有机物最终降解为无机终产物硝酸盐的过程。 3 试验概述 3.1 方法概述 土壤微生物毒性试验包括CO2吸收法和氮转化法,根据农药登记管理法规及其他规定选择相关方 法进行试验。 3.2 CO2吸收法 在标本瓶内放置两只小烧杯,其中一只盛放土壤,另一只盛放碱液(如NaOH溶液),用于吸收土壤 微生物呼吸所释放的CO2。以模拟农药常用量、10倍常用量、100倍常用量时土壤表层10cm土壤中 的农药含量设3种不同处理浓度,将标本瓶密闭并置于25℃±1℃、黑暗条件下培养,并保持土壤含水 量为最大田间持水量的40%~60%,于试验开始后的第1天、第2天、第4天、第7天、第11天、第15天 更换出密闭瓶中的碱液,测定吸收的CO2量。评价供试物对土壤微生物活性的影响。 3.3 氮转化法 过筛的土壤与适量有机底物混合后用供试物处理,同时设置一组不加供试物的对照。试验至少需 设置2个测试浓度,可参考供试物田间最大施用量设置。将土壤置于黑暗、20℃±2℃的条件下培养, 并保持土壤含水量为最大田间持水量的40%~60%,在培养0d、7d、14d和28d后,从处理组和对照 组中取出一定量的土壤样品,用合适的溶剂浸提并测定提取液中硝酸盐的含量。比较处理组与对照组 的硝酸盐形成率,计算处理组相对于对照组的百分比差异。试验至少持续28d,如果第28天处理组与 对照组的差异不小于25%,则试验需延长,最长至100d。 4 试验方法 4.1 材料和条件 4.1.1 供试物 农药制剂、原药或纯品。 4.1.2 试验土壤 4.1.2.1 CO2吸收法 选用3种具有代表性的、理化性质各异的土壤,试验前先去除土壤中的粗大物块(如石块、植物残体 等),然后过0.85mm筛。 4.1.2.2 氮转化法 试验只需一种土壤,对土壤的要求参见附录A,土壤在用于试验前要先进行处理,先去除土壤中的 粗大物块(如石块、植物残体等),然后过筛,使土壤颗粒不大于2mm。 两种方法采用的土壤最好都为新鲜土壤,如果需要在实验室储存,则应置于4℃±2℃黑暗处保 存,最长保存3个月(土壤的采集、贮存方法参见附录B)。经过储存的土壤,在试验前需进行预培养 2GB/T31270.16—2014 2d~28d。预培养期间土壤的培养条件应与试验条件一致。此外,氮转化法所用的土壤在试验前还需 补充适当的有机底物,例如,苜蓿-青草-青贮谷粉(主要组成部分:紫花苜蓿Medicagosativa),C/N比 在12/1~16/1之间。建议苜蓿粉与土壤的比率为每千克土壤(干重)用苜蓿粉5g。 4.1.3 主要仪器设备 主要仪器设备如下: ———搅拌器; ———培养箱; ———振荡器; ———离心机; ———滴定仪; ———硝酸盐测定仪; ———标本瓶及其他玻璃器皿等。 4.1.4 试验条件 4.1.4.1 CO2吸收法 土壤样品的培养条件为25℃±1℃,黑暗。试验过程中,保持土壤样品含水量在田间最大持水量 的40%~60%之间,变化范围为±5%。如有需要,可添加蒸馏水和去离子水进行调节。 4.1.4.2 氮转化法 土壤样品的培养条件为20℃±2℃,黑暗。试验过程中,保持土壤样品含水量在田间最大持水量 的40%~60%之间,变化范围为±5%。如有需要,可添加蒸馏水和去离子水进行调节。 4.2 试验操作 4.2.1 CO2吸收法 4.2.1.1 处理与对照的设置 每种土壤设3种不同浓度处理,以模拟农药常用量(推荐的最大用量)、10倍量、100倍量时土壤表 层10cm土壤中的农药含量(计算时假设土壤容重为1.5g·cm3),同时设置一组空白对照,每组至少设 置3个重复。 4.2.1.2 受试物质的制备 水溶性供试物一般用水溶解制备,避免使用水以外的其他液体,如丙酮、三氯甲烷等有机溶剂,以防 止破坏微生物菌群。对于难溶物质,可先用合适的溶剂溶解或悬浮,然后包埋石英砂(粒径:0.1mm~ 0.5mm)等惰性固体,最后等溶剂完全挥发后再将石英砂与土壤混合。为使供试物在土壤中达到一个 最佳的分布状态,建议每千克干重土壤中加入砂的比例为10g/kg。对照组的土壤样品用等量的水或 砂进行处理。混合时,应确保处理组中的供试物在土壤样品中均匀分布,同时要避免土壤压紧或结块。 4.2.1.3 土壤样品的培养 将混合后的土壤装于小烧杯中,与另一个装有标准碱液的小烧杯一起置于密闭瓶中,于25℃± 1℃、黑暗条件下培养。试验过程中,保持土壤样品含水量在田间最大持水量的40%~60%之间,变化 范围为±5%。如有需要,可添加蒸馏水和去离子水进行调节。 3GB/T31270.16—2014 4.2.1.4 样品的采集与分析 试验开始后的第1天、第2天、第4天、第7天、第11天、第15天时更换出密闭瓶中的碱液,用滴定 法间接测定吸收的CO2量。 4.2.2 氮转化法 4.2.2.1 处理与对照的设置 试验至少需设置2个测试浓度,低浓度应至少能反映实际条件下能到达土壤的最大量(计算时假定 供试物与5cm的土壤均匀混合,且土壤容重为1.5g·cm3),而高浓度应是低浓度的倍数。对于直接施 用至土壤的农药,应将试验浓度设置为最大预测环境浓度以及5倍的该浓度。对于在1个季节中多次 施入土壤的农药,其较低试验浓度应为最大施用次数与最大预测环境浓度的乘积。但是,试验浓度的上 限不应超过最大单次施用量的10倍。试验同时还需设置一组空白对照,每组至少设置3个重复。 4.2.2.2 受试物质的制备 水溶性供试物一般用水溶解制备,避免使用水以外的其他液体,如丙酮、三氯甲烷等有机溶剂