ICS65.100 B13 中华人民共和国国家标准 GB/T31270.14—2014 化 化学农药环境安全评价试验准则 第14部分:藻类生长抑制试验 Testguidelinesonenvironmentalsafetyassessmentforchemicalpesticides— Part14:Algagrowthinhibitiontest 2014-10-10发布 2015-03-11实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 GB/T31270《化学农药环境安全评价试验准则》分为21个部分: ———第1部分:土壤降解试验; ———第2部分:水解试验; ———第3部分:光解试验; ———第4部分:土壤吸附/解吸试验; ———第5部分:土壤淋溶试验; ———第6部分:挥发性试验; ———第7部分:生物富集试验; ———第8部分:水-沉积物系统降解试验; ———第9部分:鸟类急性毒性试验; ———第10部分:蜜蜂急性毒性试验; ———第11部分:家蚕急性毒性试验; ———第12部分:鱼类急性毒性试验; ———第13部分:溞类急性活动抑制试验; ———第14部分:藻类生长抑制试验; ———第15部分:蚯蚓急性毒性试验; ———第16部分:土壤微生物毒性试验; ———第17部分:天敌赤眼蜂急性毒性试验; ———第18部分:天敌两栖类急性毒性试验; ———第19部分:非靶标植物影响试验; ———第20部分:家畜短期饲喂毒性试验; ———第21部分:大型甲壳类生物毒性试验。 本部分是GB/T31270的第14部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由中华人民共和国农业部提出并归口。 本部分负责起草单位:农业部农药检定所、环保部南京环境科学研究所。 本部分主要起草人:曲甍甍、杨亚哲、瞿唯钢、周军英、李学锋、查金苗、严海娟。 ⅠGB/T31270.14—2014 化学农药环境安全评价试验准则 第14部分:藻类生长抑制试验 1 范围 GB/T31270的本部分规定了藻类生长抑制试验的材料、条件、操作、质量控制、数据处理、试验报 告等的基本要求。 本部分适用于为化学农药登记而进行的藻类生长抑制试验,其他类型的农药可参照使用。 本部分不适用于易挥发和难溶解的化学农药。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 半效应浓度 medianeffectiveconcentration 在生长抑制试验中,使供试生物生物量增长或者生长率比对照下降50%时的供试物浓度,用EC50 表示。在本部分中,通过藻类生物量增长的抑制百分率计算而得到的半效应浓度用EyC50表示,通过藻 类生长率的抑制百分率计算而得的半效应浓度用ErC50表示。 注:单位为mga.i./L。 2.2 平均生长率 averagegrowthrate 一定暴露时间内藻类单位生物量增长的对数值,在本部分中用μ表示。 2.3 生物量增长 yield 一段暴露时间内藻类单位生物量的增加量,即暴露结束时的单位生物量减去暴露开始时的单位生 物量,在本部分中用Y表示。 2.4 供试物 testsubstance 试验中需要测试的物质。 2.5 化学农药 chemicalpesticide 利用化学物质人工合成的农药。其中有些以天然产品中的活性物质为母体,进行仿制、结构改造, 创新而成,为仿生合成农药。 同义词:有机合成农药syntheticorganicpesticide。 [NY/T1667.1—2008,定义2.3.1] 2.6 原药 technicalmaterial 在制造过程中得到的有效成分及杂质组成的最终产品,不能含有可见的外来物质和任何添加物,必 要时可加入少量的稳定剂。 [NY/T1667.2—2008,定义2.5.1] 1GB/T31270.14—2014 2.7 制剂 formulationproduct 由农药原药(或母药)和助剂制成使用状态稳定的产品。 [NY/T1667.2—2008,定义3.1] 2.8 有效成分 activeingredient;a.i. 农药产品中具有生物活性的特定化学结构成分。 [NY/T1667.2—2008,定义3.1] 2.9 参比物质 referencesubstances 在测试中为证实或否定供试物的某种特性或判断测试系统有效性而使用的化学物质或混合物。 3 试验概述 本试验用供试物配制一系列不同浓度的试验药液,然后将试验药液与藻液混合后,连续72h观察 试验用藻的生长抑制情况,并求出半效应浓度EC50(72h)值以及95%置信限。 4 试验方法 4.1 材料和条件 4.1.1 供试生物 试验用藻推荐采用普通小球藻(Chlorellavulgaris)、斜生栅列藻(Desmodesmussubspicatus)或羊 角月芽藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)等。 4.1.2 供试物 农药制剂、原药或纯品。对难溶于水的农药,可用少量对藻毒性小的有机溶剂、乳化剂或分散剂助 溶,用量不得超过0.1mL(g)/L。 4.1.3 主要仪器设备 主要仪器设备如下: ———酸度计; ———血球计数板; ———分光光度计; ———显微镜; ———人工气候箱; ———高压蒸汽灭菌锅; ———玻璃器皿等。 4.1.4 培养基 推荐选择水生4号培养基培养斜生栅列藻,选择BG11培养基培养羊角月芽藻,选择BG11培养基 或SE培养基培养普通小球藻,上述培养基配方参见附录A。若使用其他培养基应同时提供培养基名 称和配方等信息;若使用其他藻种,应选择适宜的培养基,并同时提供培养基名称和配方等信息。 2GB/T31270.14—2014 4.1.5 试验条件 试验环境温度21℃~24℃(单次试验温度控制在±2℃);连续均匀光照,光照强度差异应保持在 ±15%范围内,光强4440lx~8880lx。 4.2 试验操作 4.2.1 试验用藻的预培养 按无菌操作法将试验用藻接种到装有培养基的锥形瓶内,在4.1.5的条件下培养。每隔96h接种 一次,反复接种2次~3次,使藻基本达到同步生长阶段,以此作为试验用藻。每次接种时在显微镜下 观察,检查藻种的生长情况。 4.2.2 预试验 按正式试验的条件,以较大的间距设置若干组浓度,求出供试物使试验用藻生长受抑制的最低浓度 和不受抑制的最高浓度,在此范围内设置正式试验的浓度。 4.2.3 正式试验 在预试验确定的浓度范围内以一定比例间距(几何级差应控制在3.2倍以内)设置5个~7个浓度 组,并设一个空白对照组,使用助溶剂的还应增设溶剂对照组,每个浓度组设3个重复。试验观察期为 72h,每隔24h取样,在显微镜下用血球计数板准确计数藻细胞数,或用分光光度计直接测定藻的吸光 率。用血球计数板计数时,同一样品至少计数两次,如计数结果相差大于15%,应予重复计数。依据试 验物质性质选择合适的技术方法。 4.2.4 限度试验 设置上限浓度为100mga.i./L,即在供试物达100mga.i./L时,未对藻产生影响。若供试物溶解 度小于100mga.i./L,则采用其溶解度上限作为试验浓度。对照组和处理组至少设置6个重复,并且 对浓度组和对照组进行差异显著性分析(比如t检验)。 4.2.5 参比物质试验 为检验实验室的设备、条件、方法及供试生物的质量是否合乎要求,设置参比物质作方法学上的可 靠性检验。使用参比物质(每年至少两次)对绿藻进行检测,推荐使用3,5-二氯苯酚和重铬酸钾。 4.3 数据处理 4.3.1 生物量增长的抑制百分率 处理组藻类生物量增长的抑制百分率按式(1)计算: Iy=Yc-Yt Yc×100 …………………………………(1) 式中: Iy———处理组生物量增长的抑制百分率,%; Yc———空白对照组测定的藻类单位生物量,用细胞数表示时单位为个每毫升(个/mL); Yt———处理组测定的藻类单位生物量,用细胞数表示时单位为个每毫升(个/mL)。 4.3.2 生长率的抑制百分率 处理组藻类生长率的抑制百分率按式(2)计算: 3GB/T31270.14—2014 Ir=μc-μt μc×100 …………………………………(2) 式中: Ir———处理组藻类生长率的抑制百分率,%; μc———空白对照组生长率的平均值; μt———处理组生长率平均值。 其中μ按式(3)计算: μj-i=lnXj-lnXi tj-ti…………………………………(3) 式中: μj-i———在时间点i到时间点j之间的平均生长率; Xi———在时间点i时的藻类单位生物量,用细胞数表示时单位为个每毫升(个/mL); Xj———在时间点j时的藻类单位生物量,用细胞数表示时单位为个每毫升(个/mL)。 4.3.3 半效应浓度 4.3.3.1 统计分析方法的选择 按藻类生物量增长的抑制百分率和藻类生长率的抑制百分率分别计算半效应浓度EyC50和ErC50。 采用合适的统计学软件分析藻类数据,计算得到每一观察时间(24h、48h、72h)的半效应浓度和95% 置信限。 4.3.3.2 寇氏法 用寇氏法可求出藻类在24h、48h和72h的EC50值及95%置信限。 EC50的计算见式(4): logEC50=Xm-i(∑P-0.5) ……………………(4) 式中: Xm———最高浓度的对数; i———相邻浓度比值的对数; ∑P———各组抑制率的总和(以小数表示)。 95%置信限