ICS65.100 B13 中华人民共和国国家标准 GB/T31270.10—2014 化 化学农药环境安全评价试验准则 第10部分:蜜蜂急性毒性试验 Testguidelinesonenvironmentalsafetyassessmentforchemical pesticides—Part10:Honeybeeacutetoxicitytest 2014-10-10发布 2015-03-11实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 GB/T31270《化学农药环境安全评价试验准则》分为21个部分: ———第1部分:土壤降解试验; ———第2部分:水解试验; ———第3部分:光解试验; ———第4部分:土壤吸附/解吸试验; ———第5部分:土壤淋溶试验; ———第6部分:挥发性试验; ———第7部分:生物富集试验; ———第8部分:水-沉积物系统降解试验; ———第9部分:鸟类急性毒性试验; ———第10部分:蜜蜂急性毒性试验; ———第11部分:家蚕急性毒性试验; ———第12部分:鱼类急性毒性试验; ———第13部分:溞类急性活动抑制试验; ———第14部分:藻类生长抑制试验; ———第15部分:蚯蚓急性毒性试验; ———第16部分:土壤微生物毒性试验; ———第17部分:天敌赤眼蜂急性毒性试验; ———第18部分:天敌两栖类急性毒性试验; ———第19部分:非靶标植物影响试验; ———第20部分:家畜短期饲喂毒性试验; ———第21部分:大型甲壳类生物毒性试验。 本部分是GB/T31270的第10部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由中华人民共和国农业部提出并归口。 本部分负责起草单位:农业部农药检定所、环保部南京环境科学研究所。 本部分主要起草人:袁善奎、徐晖、瞿唯钢、单正军、卜元卿、严清平、王会利。 ⅠGB/T31270.10—2014 化学农药环境安全评价试验准则 第10部分:蜜蜂急性毒性试验 1 范围 GB/T31270的本部分规定了蜜蜂急性经口毒性试验和急性接触毒性试验的材料、条件、操作、质 量控制、数据处理、试验报告等的基本要求。 本部分适用于为化学农药登记而进行的蜜蜂急性经口毒性试验和急性接触毒性试验,其他类型的 农药可参照使用。 本部分不适用于易挥发和难溶解的化学农药。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 半致死剂量 medianlethaldose 在急性经口试验或急性接触毒性试验中,引起50%的供试生物死亡时供试物剂量,用LD50表示。 注:单位为μga.i./蜂。 2.2 供试物 testsubstance 试验中需要测试的物质。 2.3 化学农药 chemicalpesticide 利用化学物质人工合成的农药。其中有些以天然产品中的活性物质为母体,进行仿制、结构改造, 创新而成,为仿生合成农药。 同义词:有机合成农药syntheticorganicpesticide。 [NY/T1667.1—2008,定义2.3.1] 2.4 原药 technicalmaterial 在制造过程中得到的有效成分及杂质组成的最终产品,不能含有可见的外来物质和任何添加物,必 要时可加入少量的稳定剂。 [NY/T1667.2—2008,定义2.5.1] 2.5 制剂 formulationproduct 由农药原药(或母药)和助剂制成使用状态稳定的产品。 [NY/T1667.2—2008,定义2.4] 2.6 有效成分 activeingredient;a.i. 农药产品中具有生物活性的特定化学结构成分。 [NY/T1667.2—2008,定义3.1] 1GB/T31270.10—2014 2.7 参比物质 referencesubstances 在测试中为证实或否定供试物的某种特性或判断测试系统有效性而使用的化学物质或混合物。 3 试验概述 3.1 方法概述 蜜蜂急性毒性试验包括急性经口毒性试验方法和蜜蜂急性接触毒性试验方法,根据农药登记管理 法规及其他规定选择相关方法进行试验。 3.2 急性经口毒性 将不同剂量的供试物分散在蔗糖溶液中,用以饲喂成年工蜂,并对药液的消耗量进行测定,药液消 耗完后饲喂不含供试物的蔗糖溶液。在48h的试验期间每天记录蜜蜂的中毒症状及死亡数,并求出 24h和48h的LD50值及95%置信限。 3.3 急性接触毒性 在蜜蜂被麻醉后,将不同浓度试验药液点滴在试验用蜜蜂的中胸背板处,待溶剂挥发后,将蜜蜂转 入试验笼中,用脱脂棉浸泡适量蔗糖水饲喂。在48h的试验期间每天记录蜜蜂的中毒症状及死亡数, 并求出24h和48h的LD50值及95%置信限。 4 试验方法 4.1 材料和条件 4.1.1 供试生物 试验用蜜蜂推荐使用意大利成年工蜂(ApismelliferaL.),供试蜜蜂应在清晨或前一日夜晚收集; 避免在早春和晚秋季节进行蜜蜂试验,如果在早春和晚秋季节进行试验,要在试验环境下以蜂巢花粉饲 喂一周;蜜蜂接受抗生素、抗螨虫药物后四周内不得用于试验。试验蜜蜂要求为健康、大小一致的个体。 用于急性经口毒性试验的蜜蜂应在试验前饥饿2h。 4.1.2 供试物 农药制剂、原药或纯品。难溶于水的可用少量对蜜蜂毒性小的有机溶剂、乳化剂或分散剂助溶。 4.1.3 主要仪器设备 主要仪器设备如下: ———试验蜂笼; ———电子天平; ———人工气候室; ———微量点滴仪; ———饲喂器等。 4.1.4 试验条件 试验在温度25℃±2℃、相对湿度50%~70%、黑暗条件下进行。 2GB/T31270.10—2014 4.2 试验操作 4.2.1 急性经口毒性 4.2.1.1 预试验 按正式试验的条件,以较大间距设置4个~5个剂量组,通过预试验求出试验用蜂最高全存活剂量 与最低全致死剂量。 4.2.1.2 正式试验 根据预试验确定的浓度范围按一定比例间距(几何级差应控制在2.2以内)设置5个~7个剂量组, 每组至少需10只蜜蜂,并设空白对照组,使用有机溶剂助溶的还需设置溶剂对照组。将贮蜂笼内的蜜 蜂引入试验笼中,然后在饲喂器(如离心管、注射器等)中加入100μL~200μL含有不同浓度供试物的 50%(质量浓度)蔗糖水溶液,并对每组药液的消耗量进行测定。一旦药液消耗完(通常需要3h~4h), 将食物容器取出,换用不含供试物的蔗糖水进行饲喂(不限量)。对于一些供试物,在较高试验剂量下, 蜜蜂拒绝进食,从而导致食物消耗很少或几乎没有消耗的,最多延长至6h,并对食物的消耗量进行测 定(即测定该处理的食物残存的体积或重量)。对照组及各处理组均设3个重复。观察记录处理24h、 48h后的中毒症状和死亡数。在对照组的死亡率低于10%的情况下,若处理24h和48h后的死亡率 差异达到10%以上时,还需将观察时间最多延长至96h。 4.2.1.3 限度试验 设置上限剂量100μga.i./蜂,即在供试物达100μga.i./蜂时仍未见蜜蜂死亡,则无需继续试验。 如供试物溶解度小于100μga.i./蜂,则采用最大溶解度作为上限浓度。 4.2.2 急性接触毒性 4.2.2.1 预试验 按正式试验的条件,以较大间距设置4个~5个剂量组,通过预试验求出试验用蜂最高全存活剂量 与最低全致死剂量。 4.2.2.2 正式试验 根据预试验确定的剂量范围按一定比例间距(几何级差应控制在2.2以内)设置5个~7个剂量组, 每个处理至少需10只蜜蜂。同时设空白对照组及溶剂对照组,对照组及每一剂量组均设3个重复。供 试物用丙酮等溶剂溶解,配制成不同浓度的药液。对准蜜蜂中胸背板处,用微量点滴仪分别点滴各浓度 供试药液1.0μL~2.0μL,待蜂身晾干后转入试验笼中,用50%(质量浓度)蔗糖水饲喂。观察记录处理 24h、48h后的中毒症状和死亡数。在对照组的死亡率低于10%的情况下,若处理24h和48h后的死 亡率差异达到10%以上时,还需将观察时间最多延长至96h。 4.2.2.3 限度试验 设置上限剂量100μga.i./蜂,即在供试物达100μga.i./蜂时仍未见蜜蜂死亡,则无需继续试验。 如供试物溶解度小于100μga.i./蜂,则采用最大溶解度作为上限浓度。 4.2.3 参比物质试验 为检验实验室的设备、条件、方法及供试生物的质量是否合乎要求,设置参比物质作方法学上的可 3GB/T31270.10—2014 靠性检验。定期(至少6个月一次)进行参比物质急性经口毒性试验和急性接触毒性试验,参比物质推 荐为乐果。 4.3 数据处理 4.3.1 统计分析方法的选择 可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法计算每一观察时间(24h、48h)的蜜蜂经口毒性和接 触毒性的半致死剂量LD50,也可采用数据统计软件进行分析和计算。 4.3.2 寇氏法 用寇氏法可求出蜜蜂在24h和48h的LD50值及95%置信限。 LD50的计算见式(1): logLD50=Xm-i(∑p-0.5) …………………………(1) 式中: Xm———最高浓度的对数; i———相邻浓度比值的对数; ∑p———各组死亡率的总和(以小数表示)。 95%置信限的计算见式(2): 95%置信限=logLD50±1.96SlogLD50 …………………(2) 标准误的计算见式(3): SlogLD50=i∑pq n…………………………(3) 式中: p———1个组的死亡率; q———1-p; n———各浓度组蜜蜂的数量。 4.3.