中华人民共和国国家标准 GB4789.12—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 肉毒梭菌及肉毒毒素检验 2016-12-23发布 2017-06-23实施 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 国家食品药品监督管理总局发布GB4789.12—2016 Ⅰ 前 言 本标准代替GB/T4789.12—2003《食品卫生微生物学检验 肉毒梭菌及肉毒毒素检验》。 本标准与GB/T4789.12—2003相比,主要变化如下: ———标准名称修改为“食品安全国家标准 食品微生物学检验 肉毒梭菌及肉毒毒素检验”; ———增加了PCR鉴定方法; ———增加了结果与报告; ———增加了附录A; ———修改了设备和材料; ———修改了培养基和试剂; ———修改了检验程序; ———规范了样品制备过程; ———修改了操作步骤中增菌和分离培养部分试验方法。GB4789.12—2016 1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 肉毒梭菌及肉毒毒素检验 1 范围 本标准规定了食品中肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)及肉毒毒素(botulinumtoxin)的检验 方法。 本标准适用于食品中肉毒梭菌及肉毒毒素的检验。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下: 2.1 冰箱:2℃~5℃、-20℃。 2.2 天平:感量0.1g。 2.3 无菌手术剪、镊子、试剂勺。 2.4 均质器或无菌乳钵。 2.5 离心机:3000r/min、14000r/min。 2.6 厌氧培养装置。 2.7 恒温培养箱:35℃±1℃、28℃±1℃。 2.8 恒温水浴箱:37℃±1℃、60℃±1℃、80℃±1℃。 2.9 显微镜:10倍~100倍。 2.10 PCR仪。 2.11 电泳仪或毛细管电泳仪。 2.12 凝胶成像系统或紫外检测仪。 2.13 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 2.14 可调微量移液器:0.2μL~2μL、2μL~20μL、20μL~200μL、100μL~1000μL。 2.15 无菌吸管:1.0mL、10.0mL、25.0mL。 2.16 无菌锥形瓶:100mL。 2.17 培养皿:直径90mm。 2.18 离心管:50mL、1.5mL。 2.19 PCR反应管。 2.20 无菌注射器:1.0mL。 2.21 小鼠:15g~20g,每一批次试验应使用同一品系的KM或ICR小鼠。 3 培养基和试剂 除另有规定外,PCR试验所用试剂为分析纯或符合生化试剂标准,水应符合GB/T6682中一级水 的要求。GB4789.12—2016 2 3.1 庖肉培养基:见A.1。 3.2 胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉汤(TPGYT):见A.2。 3.3 卵黄琼脂培养基:见A.3。 3.4 明胶磷酸盐缓冲液:见A.4。 3.5 革兰氏染色液:见A.5。 3.6 10%胰蛋白酶溶液:见A.6。 3.7 磷酸盐缓冲液(PBS):见A.7。 3.8 1mol/L氢氧化钠溶液。 3.9 1mol/L盐酸溶液。 3.10 肉毒毒素诊断血清。 3.11 无水乙醇和95%乙醇。 3.12 10mg/mL溶菌酶溶液。 3.13 10mg/mL蛋白酶K溶液。 3.14 3mol/L乙酸钠溶液(pH5.2)。 3.15 TE缓冲液。 3.16 引物:根据表1中序列合成,临用时用超纯水配制引物浓度为10μmol/L。 3.17 10×PCR缓冲液。 3.18 25mmol/LMgCl2。 3.19 dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。 3.20 Taq酶。 3.21 琼脂糖:电泳级。 3.22 溴化乙锭或Goldview。 3.23 5×TBE缓冲液。 3.24 6×加样缓冲液。 3.25 DNA分子量标准。 4 检验程序 肉毒梭菌及肉毒毒素检验程序见图1。