ICS 65.150 B 50 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 1779—2011 水产苗种中硝基呋喃类原药残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 2011-01-06 发布 山东省质量技术监督局 2011-03-01 实施 发 布 DB37/T 1779—2011 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省海洋与渔业厅提出。 本标准由山东省海洋渔业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省海洋水产研究所、山东省水产品质量检验中心 。 本标准主要起草人：孙玉增、徐英江、田秀慧、张世娟、李佳蔚、于召强。 I DB37/T 1779—2011 水产苗种中硝基呋喃类原药残留量的测定液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了水产苗种中硝基呋喃类原药残留量测定的液相色谱-串联质谱法。 本标准适用于水产苗种中呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮残留量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 《水产苗种违禁药物抽检技术规范》农业部1192号公告-1-2009 3 原理 样品中硝基呋喃类原药残留用甲醇－偏磷酸溶液提取，经固相萃取柱净化后，用液相色谱-串联质 谱仪测定，外标法定量。 4 试剂和材料 4.1 试验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规定。所用试剂除另有指定外，均为分析纯。 4.2 甲醇：色谱纯。 4.3 偏磷酸。 4.4 乙酸铵。 4.5 0.2%偏磷酸溶液：0.2 g 偏磷酸加 100 mL 水溶解，混匀。 4.6 甲醇-偏磷酸溶液（40＋60）：甲醇（4.1）40 mL 加 0.2 %偏磷酸溶液（4.4）60 mL，混匀。 4.7 5.0 mmol/L 乙酸铵溶液：称取乙酸铵（4.3）0.19 g 用水溶解并定容至 500 mL。 4.8 标准品：呋喃唑酮和呋喃西林纯度均为 99.0%，呋喃妥因纯度为 98.5 %，呋喃它酮纯度为 94.0 %。 4.9 标准储备液（100 μg/ mL）:准确称取呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮各适量，用甲 醇溶解并定容至 100 mL 棕色容量瓶中，配成浓度为 100 μg/mL 的标准储备液，－18 ℃冰箱中保存， 保存期 6 个月。 4.10 混合标准工作溶液：使用前取标准储备液（4.8），用甲醇稀释成所需浓度。 5 5.1 5.2 5.3 仪器和设备 液相色谱-串联质谱仪，配电喷雾（ESI）离子源。 涡旋混合器。 离心机：7000 r/min。 1 DB37/T 1779—2011 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6 天平（感量 0.001 g）。 分析天平（感量 0.00001 g）。 HLB 固相萃取柱（60 mg，3 mL）。 均质机。 超声波清洗仪。 氮吹仪。 试样的测定 6.1 样品的制备 按照《水产苗种违禁药物抽检技术规范》执行。 6.2 样品的提取 称取匀浆后样品10.0 g 于50 mL 离心管中，加入15 mL 甲醇－偏磷酸溶液（4.5），涡旋混合30 s， 超声提取 10 min，7 000 r/min 离心10 min，取上清液于至另一离心管中，再用15 mL 甲醇-偏磷酸溶 液提取一次，合并上清液，备用。 6.3 样品的净化 HLB固相萃取小柱依次用5 mL水和5 mL甲醇活化，取备用液全部过柱（流速不超过1 mL/min），用5 mL 10 %甲醇淋洗，用5 mL 甲醇洗脱，35 ℃水浴氮气吹近干。残渣用流动相溶解，定容至1 mL，过0.22 μm滤膜，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。 6.4 测定 6.4.1 6.4.1.1 6.4.1.2 6.4.1.3 6.4.1.4 6.4.1.5 6.4.1.6 色谱条件 色谱柱：BEH C18，2.1×100 mm，1.7 μm；或相当者。 流动相：A 相：5.0 mmol/L 乙酸铵溶液；B 相：甲醇。 流速：0.25 mL/min。 进样量：10 μL。 柱温：35 ℃。 流动相梯度洗脱程序见表 1。 表1 6.4.2 流动相梯度洗脱程序 时间，min A 相，% B 相，% 0 95 5 1.0 95 5 3.0 5 95 4.0 5 95 5.0 95 5 质谱条件 条件包括： 2 DB37/T 1779—2011 a) b) c) d) e) f) g) h) 离子源：电喷雾离子源； 扫描方式：正离子扫描（ESI+）和负离子扫描(ESI-)分段扫描； 检测方式：多反应监测（MRM）； 电离电压：2.5 kV； 离子源温度：110 ℃； 雾化温度：350 ℃； 雾化气流速：700 L/h； 各药物母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量和离子化方式见表 2。 表2 硝基呋喃类药物的母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量和离子化方式 目标化合物 呋喃唑酮 呋喃西林 呋喃妥因 呋喃它酮 母离子 子离子 锥孔电压 碰撞能量 m/z m/z V eV 225.8 121.6* 28 20 225.8 138.7 28 15 197.0 80.0 15 10 197.0 124.0 * 15 10 236.8 123.0 28 12 236.8 151.0 * 28 15 325.0 251.9 28 15 325.0 * 28 12 281.0 离子化方式 ESI+ ESI- ESI- ESI+ 注：* 为定量碎片离子 6.4.3 6.4.3.1 液相色谱-串联质谱分析 定性方法 在同样测试条件下，阳性样品保留时间与标准物质保留时间相对标准偏差在±5%以内，且检测到的 离子的相对丰度，用与最强离子（基峰）的强度百分比表示，应当与浓度相当的校正标准相对丰度一致， 校正标准可以是校正标准品溶液，也可以是添加了标准物质的样品。基峰与次强碎片离子丰度比应符合 表3要求。 表3 6.4.3.2 基峰与次强碎片离子丰度比要求 相对丰度，% 允许偏差，% ＞50 ±20 ＞20～50 ±25 ＞10～20 ±30 ≤10 ±50 定量方法 按6.4.1和6.4.2 设定仪器条件，待仪器稳定后，将混合标准工作液和样品制备液等体积进样测定， 外标法定量。 7 计算 3 DB37/T 1779—2011 试样中硝基呋喃类原药残留量按公式（1）计算，计算结果需扣除空白值，结果保留三位有效数字。 X = ρ ×V m ....................................... (1) 式中： X——样品中硝基呋喃类原药留量，单位为微克每千克（μg/kg）； ρ——样品溶液中硝基呋喃类原药的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V——样品最终定容体积，单位为毫升（mL）； m——样品的质量，单位为克（g）。 8 灵敏度 呋喃唑酮和呋喃它酮的检出限为0.20 μg/kg、定量限为0.5 μg/kg，呋喃西林和呋喃妥因的检出 限0. 5 μg/kg、定量限为1.0 μg/kg。 9 准确度 本方法回收率为70 %～120 %。 10 精密度 本方法批内相对标准偏差≤10 %，批间相对标准偏差≤15 %。 11 方法的线性范围 呋喃唑酮和呋喃它酮的线性范围：1.0 ng/mL～100.0 ng/mL，呋喃西林和呋喃妥因的线性范围：2.0 ng/mL～100.0 ng/mL。 4 DB37/T 1779—2011 AA 附 录 A （资料性附录） 色谱图 2009_0516-13 4: MRM of 2 Channels ES+ 2009_0516-13 225.8 > 138.7 3.11e5 1: MRM of 2 Channels ES197 > 124 3.33e3 2.88 % % 2.98 3.07 0.82 0 1.00 2.00 3.00 4.00 2009_0516-13 1.00 2.00 3.00 4.02 4.35 4.00 5.00 1: MRM of 2 Channels ES197 > 80 3.13e3 2.88 % % 3.01 2 5.00 4: MRM of 2 Channels ES+ 2009_0516-13 225.8 > 121.6 3.29e5 2.99 3.83 3.97 1.33 0 Time 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 2.00 3.00 4.00 5.76 5.00 3: MRM of 2 Channels ES+ 325 > 281 2.96e6 3.00 % % 2.89 5.11 Time 1.00 2: MRM of 2 Channels ES- 2009_0516-13 236.8 > 151.6 1.23e4 2009_0516-13 4.51 4.89 2 1 1.00 2.00 3.00 4.00 2009_0516-13 1.00 2.00 3.00 4.00 3.00 5.00 3: MRM of 2 Channels ES+ 325 > 251.9 2.31e6 % % 2.91 0 5.00 2: MRM of 2 Channels ES- 2009_0516-13 236.8 > 123.6 2.03e3 0.07 0.72 3.81 1.26 4.44 4.68 3 Time 1.00 2.00 图A.1 3.00 4.00 5.00 0 Time 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 四种硝基呋喃原药混合标准（10.0 ng/mL）质量色谱图 5 DB37/T 1779—2011 2009_0516-28 4: MRM of 2 Channels ES+ 5.20 225.8 > 138.7 1.24e3 2009_0516-28 100 0.98 3.10 1.50 2.00 0.11 3.00 2.62 3.50 4.00 2.85 2.59 0.76 3.19 3 0.50 5.00 5.50 2009_0516-28