ICS 65.120 B46 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1276—2012 饲料中三聚氰胺快速检测 酶联免疫吸附法 Rapid detection of melamine in the feed Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） 2012 - 07 - 23 发布 福建省质量技术监督局 2012 - 10 - 20 实施 发 布 DB35/T 1276—2012 前 言 本标准根据 GB/T 1.1-2009 给出的规则编写。 本标准由福建省农业厅提出并归口。 本标准主要起草单位：福建蓝昊生物技术有限公司、国家加工食品质量监督检验中心（福州）、福 建出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：李昊、郑小严、陈健、翁惠玲、王天西、林钦、何孟杭、沈晓妙、高小尧、 饶平凡。 I DB35/T 1276—2012 饲料中三聚氰胺快速检测 酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了饲料中三聚氰胺的酶联免疫吸附测定（ELISA）方法。 本标准适用于饲料原料、预混合饲料、配合饲料、浓缩饲料中三聚氰胺的测定。 本方法定量测定检出限为 0.01 mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 20195 3 动物饲料 试样的制备 原理 试样中三聚氰胺、酶标三聚氰胺抗原与包被于微量反应板中的三聚氰胺抗体进行免疫竞争反应，加 入酶底物后显色，试样中三聚氰胺含量与颜色深度成反比，用目测法与三聚氰胺标准系列进行半定量检 测，用仪器法进行定量检测。 4 试剂和材料 除非另有规定，所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子或相当纯度的水。 4.1 三聚氰胺酶联免疫试剂盒中的试剂 4.1.1 包被抗三聚氰胺抗体的聚苯乙烯微量反应板。 4.1.2 样品稀释液（0.01 mol/L pH7.4 磷酸盐缓冲液）：称取 3.628 g 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、 0.2000 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）、8.000 g 氯化钠（NaCl）、0.2000 g 氯化钾（KCl），加水溶解，定 容至 1L。 4.1.3 三聚氰胺标准溶液：准确称取 0.1000 g 三聚氰胺加甲醇溶解，并用甲醇定容至 100 mL，配制 成 1 mg/mL 三聚氰胺标准溶液。用样品稀释液进行精确稀释（用容量瓶），得到三聚氰胺标准溶液，浓 度为 0μg/mL、0.01μg/mL、0.03μg/mL、0.1μg/mL、0.3μg/mL、1μg/mL。 4.1.4 三聚氰胺酶标记物：三聚氰胺-辣根过氧化物酶交联物。 1 DB35/T 1276—2012 4.1.5 清洗液：吸取 0.5 mL 吐温-20 于 1000 mL 样品稀释液中。 4.1.6 底物溶液：3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液。 4.1.7 反应终止液：硫酸溶液，c（H2SO4）=1 mol/L。 4.2 5 正己烷。 仪器和设备 5.1 小型粉碎机。 5.2 分析天平：感量 0.0001 g 和 0.01 g。 5.3 离心管：15 mL。 5.4 涡旋混合器。 5.5 离心机。 5.6 酶标测定仪：内置 450 nm 和 630 nm 滤光片。 5.7 移液器及配套吸头：20 μL～1000 μL。 6 分析步骤 6.1 试样制备 按GB/T 20195规定进行饲料试样制备。 6.2 试样提取 6.2.1 称取 1 g（精确至 0.01 g）试样，置于 15 mL 离心管中，加入样品稀释液 5 mL 和正己烷 5 mL， 在涡旋混合器上振荡 1 min，3500 rpm 离心 15 min。 6.2.2 用移液器移去上层悬浊液，再用移液器吸取下层溶液 100 µL 至 1.5 mL 离心管中，加入样品稀 释液 500 µL 备用。 6.3 测定步骤 6.3.1 试剂平衡 将测试盒于室温中放置 30 min。 6.3.2 测定 6.3.2.1 在微量反应板中各孔，分别加入三聚氰胺标准溶液和完成提取的试样溶液各 100 µL。再每孔 加入 50 µL 三聚氰胺酶标记物，轻轻平晃反应板。室温（20℃~28℃）避光静置反应 50 min。 6.3.2.2 将反应板中反应液用力甩干，每孔加 200 µL 清洗液洗板 3 次，每次洗板时间 2 min，甩掉清 洗液，在吸水纸上拍干。 2 DB35/T 1276—2012 6.3.2.3 每孔各加 100 µL 底物溶液，轻轻平晃反应板，室温（20 ℃~28 ℃）避光静置反应 20 min，每 孔加 100 µL 反应终止液，在（10～30)）min 内测定。 6.3.3 结果判定 6.3.3.1 目测法：比较试样液孔与标准溶液孔的颜色，若试样液孔颜色比标准溶液孔颜色浅，则为试 样液中三聚氰胺含量超过标准溶液三聚氰胺含量，反之则未超过。 6.3.3.2 仪器法：用酶标测定仪，在单波长 450 nm 或双波长 450 nm / 630 nm 处，测定标准溶液孔及 试样液孔吸光度 A 值，比较试样液孔 A 值与标准溶液孔 A 值，若试样液孔 A 值小于标准溶液孔 A 值 （试样孔 A 值/标准品 0 µg/mL A 值<90%），则为试样液中三聚氰胺含量超过标准溶液三聚氰胺含量， 反之则未超过。 6.4 定量测定 用酶标测定仪，在单波长450 nm 或双波长450 nm / 630 nm处进行定量测定，通过绘制三聚氰胺的 标准曲线来确定试样中三聚氰胺的含量。按限量法测定步骤测定三聚氰胺标准溶液（0.0 µg/mL、 0.01 µg/mL、0.03 µg/mL、0.1 µg/mL、0.3 µg/mL、1 µg/mL）的吸光度值A。以0.0 µg/mL三聚氰胺标准 溶液的吸光度值A0为分母，其他浓度标准溶液的吸光值A为分子的比值，再乘以100，该值为纵坐标， 对应的三聚氰胺标准溶液浓度的自然对数值为横坐标，绘制标准曲线。根据试样A/A0×100的值在标准 曲线上查得对应的三聚氰胺的含量。 试样中三聚氰胺含量以质量分数X计，单位以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（1）计算。 X = ρ × V × n m ................................. (1) 式中： ρ ——从标准曲线上查得的试样提取液中三聚氰胺含量，单位为微克每毫升（µg/mL）； V——样品稀释液体积，单位为毫升（mL）； n ——试样稀释倍数； m ——试样的质量，单位为克（g） 。 计算结果保留2位有效数字。 7 允许差 两次平行测定结果相对偏差不得超过20%。 _________________________________ 3 DB35/T 1276－2012 福 建 省 地 方 标 准 饲料中三聚氰胺快速检测 酶联免疫吸附法 DB35/T 1276—2012 * 2012 年 8 月第一版 2012 年 8 月第一次印刷