ICS 65.150 B 50 DB11 北 京 市 地 方 标 准 DB11/T 375—2017 代替 DB11/T 375-2006 水生动物检疫名录及病原检测方法 List of aquatic animal diseases and its detection method 2017 - 03 - 22 发布 北京市质量技术监督局 2017 - 07 - 01 实施 发 布 DB11/T 375—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准替代DB11/T 375—2006《水生动物检疫名录及病原检测方法》，与DB11/T 375—2006相比， 除编辑性修改外主要技术变化如下： ——修改了标准适用范围(见 1)； ——修改了检疫名录(见 3,2006 年版的 3)； ——修改了病原检测方法（见 4.2,2006 年版的 4）； ——删除了资料性附录 A、B、C、D、E、F、G、H、I、J（见 2006 年版的附录 A、B、C、D、E、F、 G、H、I、J）； ——删除了结果报告单（见 2006 年版的 5）； ——增加了采样、抽样规格、抽样水温的规定(见 4.1)； ——增加了资料性附录 A“鲫造血器官坏死病诊断规程” （见附录 A）。 请注意文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由北京市农业局提出并归口。 本标准由北京市农业局组织实施。 本标准起草单位：北京市水产技术推广站。 本标准主要起草人：曹欢、王姝、王小亮、王静波、曹洁、徐立蒲、那立海、贾丽、张文、王澎。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为: ——DB11/T 375—2006。 I DB11/T 375—2017 水生动物检疫名录及病原检测方法 1 范围 本标准给出了水生动物检疫名录及病原检测的方法。 本标准适用于水生动物检疫以及相关疫病的监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 15805.1 鱼类检疫方法 第1部分：传染性胰脏坏死病毒(IPNV) GB/T 15805.2 鱼类检疫方法 第2部分：传染性造血器官坏死病毒(IHNV) GB/T 15805.4 鱼类检疫方法 第4部分：斑点叉尾鮰病毒(CCV) GB/T 15805.5 鱼类检疫方法 第5部分：鲤春病毒血症病毒(SVCV) SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7212.1 鲤疱疹病毒检测方法 第1部分：锦鲤疱疹病毒 SN/T 2503 淡水鱼中寄生虫检疫技术规范 SN/T 3584 草鱼出血病检疫技术规范 3 检疫名录 检疫对象及其相应的检疫范围见表1。 表1 检疫名录 检 序号 疫 对 象 检 疫 范 围 1 鲤春病毒血症（Spring viraemia of carp，SVC） 鲤鱼、锦鲤、金鱼等鲤科鱼类 2 草鱼出血病（Hemorrhage disease of grass carp，GCRV） 青鱼、草鱼 3 传 染 性 造 血 器 官 坏 死 病 （ Infectious haematopoietic necrosis ,IHN） 虹鳟等冷水性鲑科鱼类 4 锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease，KHVD） 鲤、锦鲤 5 鲫造血器官坏死病（Goldfish haematopoietic necrosis ,GFHN） 金鱼、鲫 6 传染性胰脏坏死病（Infectious pancreatic necrosis ,IPN） 虹鳟等冷水性鲑科鱼类 7 斑点叉尾鮰病毒病（channel catfish virus disease ,CCVD） 斑点叉尾鮰 8 小瓜虫病（Ichthyophthiriasis） 淡水鱼类 4 病原检测 4.1 采样方法 1 DB11/T 375—2017 采样按照SC/T 7103的规定执行，抽样规格及抽样水温见表2。 表2 抽样规格及抽样水温 检 疫 对 象 序号 抽 样 规 格 抽 样 1 鲤春病毒血症 苗种或成鱼 10℃～20℃ 2 草鱼出血病 苗种或成鱼 20℃～30℃ 3 传染性造血器官坏死病 6 月龄以下苗种 8℃～15℃ 4 锦鲤疱疹病毒病 苗种或成鱼 20℃～30℃ 5 鲫造血器官坏死病 苗种或成鱼 15℃～26℃ 6 传染性胰脏坏死病 3 月龄以下苗种 10℃～14℃ 7 斑点叉尾鮰病毒病 苗种或成鱼 25℃～30℃ 8 小瓜虫病 苗种或成鱼 15℃～25℃ 4.2 检测方法 病原检测方法见表3。 表3 检测方法 序号 2 检 疫 对 象 检 测 1 鲤春病毒血症 GB/T 15805.5 2 草鱼出血病 SN/T 3584 3 传染性造血器官坏死病 GB/T 15805.2 4 锦鲤疱疹病毒病 SC/T 7212.1 5 鲫造血器官坏死病 见附录 A 6 传染性胰脏坏死病 GB/T 15805.1 7 斑点叉尾鮰病毒病 GB/T 15805.4 8 小瓜虫病 SN/T 2503 方 法 水 温 DB11/T 375—2017 AA 附 录 A （资料性附录） 鲫造血器官坏死病诊断规程 A.1 病原 鲫造血器官坏死病毒（Goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV）。 A.2 样品要求 A.2.1 水温 采集样品时的水温应在15℃～26℃。 A.2.2 品种 采样品种为金鱼、鲫及其杂交种。优先采集金鱼，其次为鲫鱼，及其它杂交品种。 A.2.3 数量 按照SC/T 7103 执行。 A.2.4 状态 已死亡鱼样不采集。 A.2.5 信息采集 需采集金鱼、鲫及其杂交种发病情况、混养其它鱼类发病情况、采样水温等信息。 A.3 临床症状及流行病学特征 A.3.1 临床症状 患金鱼造血器官坏死病的金鱼、鲫，特别是杂交种，具有下列临床症状： ——最显著的特征为鳃部严重充血, 濒死病鱼鳃部开始大量出血，血液不断的顺着鳃丝流到体外； ——体表、下颌等处分布大量点状出血点； ——病鱼没有生气，不吃食，在水面缓游，病情严重时由于严重贫血使得鳃明显退色，皮肤和鳃上 有白色斑块，症状和锦鲤发生的锦鲤疱疹病毒病不同； ——将病鱼解剖后可见其肝发白，脾和肾肿大，脾上有白色结节。 A.3.2 流行病学特征 患金鱼造血器官坏死病的金鱼、鲫，特别是杂交种，具有下列流行病学特征： ——GFHNV 具有较高的传染性，但它的感染谱较小，仅感染金鱼、鲫，特别是杂交种； ——该病流行的水温适宜范围为 15～26℃，即当池塘水温自然上升至 15℃时，疾病开始发生，而 继续上升至 26℃以上时，这种疾病发生率会大幅度下降；而当秋季温度开始下降，特别是降 3 DB11/T 375—2017 低到 26℃以下时会再次流行； ——该病严重时死亡率较高(可以达 90%以上)；被感染的鱼可以长期带毒。 A.4 实验室检测 A.4.1 试剂和材料 A.4.1.1 水：符合GB/T 6682中一级水的规格。 A.4.1.2 GFHNV阳性样品：符合国家有关规定。 A.4.1.3 Taq酶：－20℃保存，不能反复冻融或温度剧烈变化。 A.4.1.4 dNTP：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10 mmoL/L。 A.4.1.5 MgCl2：25 mmoL/L。 A.4.1.6 引物：浓度为100 pmoL/μL。其序列如下： ——CyHV-pol-F：5’-CCCAGCAACATGTGCGACGG-3’； ——CyHV-pol-R：5’-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3’。 ——扩增 CyHV 1-3 型 pol 基因 362 bp 片段。 A.4.1.7 引物：浓度为100 pmoL/μL。其序列如下： ——GFHVN-F：5’-CTACACGCCTCGCATCAT-3’； ——GFHVN-R：5’-CTCCACGGTCCTCATCTT-3’。 ——扩增 GFHNV DNA helicase 基因 451 bp 片段。 A.4.2 器材和设备 A.4.2.1 A.4.2.2 A.4.2.3 A.4.2.4 A.4.2.5 A.4.2.6 A.4.2.7 普通冰箱和超低温冰箱。 组织研磨器。 离心机和离心管。 PCR扩增仪。 水平电泳仪。 微量移液器及吸头。 紫外观察灯或凝胶成像仪。 A.4.3 样品处理 A.4.3.1 取肾、脾、鳃和脑组织，成熟雌鱼还需取卵巢液。 A.4.3.2 将所取样品匀浆成糊状，按1：10的最终稀释度悬于磷酸盐缓冲液或M199细胞培养液。 A.4.4 DNA抽提 A.4.4.1 CTAB+酚/氯仿/异戊醇抽提法 将450μL悬液放入1.5mL的离心管，再加入450μL CTAB溶液并混匀，25℃作用2小时。在含有样 品的离心管中加入600μL抽提液Ⅰ，用力混合。12000r/min离心5min，取上层水相（约800μL）。再加 入700μL抽提液Ⅱ，用力混合。12000r/min离心5min，取上层水相（约600μL）。再加入预冷的1.5倍 体积的无水乙醇（约900μL），倒置数次混匀后，放置离心管于－20℃下，至少8h后取出。12000r/min 离心30min，倒去上清液。将离心管倒置于吸水纸上，吸干液体。加11μL DEPC水溶解后，作为PCR模 板。 4 DB11/T 375—2017 A.4.4.2 DNAzol抽提法 将100μL悬液放入1.5ml的离心管，再加入1ml DNAzol，颠倒混匀5次，室温下静置5min，10600g （11400r/min）离心10min；吸取上清约1ml，加入0.5ml无水乙醇，颠倒混匀5次，室温下静置5min，18000g （15000r/min）离心30min；吸弃上清，加入500μL 75%的乙醇清洗，18000g（15000r/min）离心5min； 吸弃乙醇，干燥5min；加入50μL DEPC水（60℃预热），60℃保温5min；即为提取的DNA，作为PCR 模板。 A.4.4.3 DNA提取试剂盒抽提法 具体参照试剂盒说明书。 A.4.5 DNA扩增 A.4.5.1 扩增CyHV pol基因反应体系为100μL：在0.2mL反应管中加入10μL模板、 2.5μL dNTP、10 μL 氯化镁溶液、10μL 1