(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111401463.5 (22)申请日 2021.11.19 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 张红河　陈超一　来茂德　 (74)专利代理 机构 北京金智普华知识产权代理 有限公司 1 1401 代理人 皋吉甫 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) A61K 31/7088(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/04(2006.01) A61P 1/00(2006.01) (54)发明名称 靶向环状RNA cir cRHOBTB3的反义寡核苷酸 及在结直肠癌治 疗中的应用 (57)摘要 本发明设计并合成了靶向circRHOBTB3的 ASO药物， 可以有效提高cir cRHOBTB3在细胞中的 水平。 用所述ASO处理结直肠癌细胞以及动物肿 瘤转移模型后， 有效抑制了结直肠癌细胞在体外 的增殖、 迁移和侵袭以及在体内的转移， 为恶性 肿瘤的治 疗提供了一条途径。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图3页 CN 113980967 A 2022.01.28 CN 113980967 A 1.一种circRHOBTB3的反义寡核苷酸ASO序列ASO ‑cir， 其可以通过靶向circRHOBTB3的 环化元件， 阻碍抑制性剪接因子的结合从而提高circRHOBTB3表达水平， 所述的ASO ‑cir包 含如下序列： 5' ‑ GUUGCCTGAAGATTCATGGCUAGCA   ‑3'； 优选的， 所述的ASO ‑cir由序列5' ‑   GUUGCCTGAAGATTCATGGCUAGCA  ‑3'组成。 2.根据权利要求1所述的ASO ‑cir， 其特征在于， 所述的ASO ‑cir被修饰， 所述的修饰包 括但不限于5 ’及3’各5个碱基2 ’‑OMe修饰， 全链硫代磷酸酯键修饰， 模式为 MMMMMDDDDDDDDDDDDDDDMMMMM， 其中M代表2 ’ ‑OMe修饰的RNA， D表示未修饰的DNA， 各碱基或 碱基类似物由硫代磷酸酯键连接 。 3.一种circRHOBTB3的反义寡核苷酸ASO序列ASO ‑exo， 其可以通过靶向分泌调控元件， 抑制circRHOBTB3的外泌体分选从而提高circRHOBTB3表达水平； 所述ASO ‑exo包含如下序 列： 5'‑UAGCAAAAAGATCCTGGGTAGUUCG ‑3'， 优选的， 所述的ASO ‑exo由序列5' ‑ 5'‑ UAGCAAAAAGATCCTGGGTAGUUCG‑3'组成。 4.根据权利要求3所述的更有选 的ASO‑exo， 其特征在于， 所述的ASO ‑exo被修饰， 所述 的修饰包括但不限于5 ’及3’各5个碱基2 ’ ‑OMe修饰， 全链硫代磷酸酯键修饰， 模式为 MMMMMDDDDDDDDDDDDDDDMMMMM， 其中M代表2 ’ ‑OMe修饰的RNA， D表示未修饰的DNA， 各碱基或 碱基类似物由硫代磷酸酯键连接 。 5.一种可提高circRHOBTB3表达的组合物， 包括了权利要求1或2中所述的ASO ‑cir以及 药学上可接受的载体。 6.一种可提高circRHOBTB3表达的组合物， 包括了权利要求3或4 中所述的ASO ‑exo以及 药学上可接受的载体。 7.一种可提高circRHOBTB3表达的组合物， 包括了权利要求1或2中所述的ASO ‑cir、 权 利要求3或4中所述的ASO ‑exo以及药 学上可接受的载体。 8.权利要求1或2所述的AS O‑cir在制备抑制癌症药物中的应用， 优选的， 所述的癌症为 结直肠癌。 9.权利要求3或4所述的AS O‑exo在制备抑制癌症药物中的应用， 优选的， 所述的癌症为 结直肠癌。 10.权利要求5 ‑7任一项所述的组合物在制备抑制癌症药物中的应用， 优选的， 所述的 癌症为结直肠癌。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113980967 A 2靶向环状RNA  circRHOBTB3的反义寡核 苷酸及在结直肠癌治 疗中的应用 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学领域， 涉及ASO药物的设计及应用。 具体来说， 本发明针对 人circRHOB TB3的环化及分泌调控 元件序列分别设计合成了两条反义寡核苷 酸ASO， 通过促 进circRHOBTB3以及抑制circRHOBTB3的外泌体分选从而提高其细胞内表达， 所述ASO可在 体内外抑制结直肠癌细胞的生长和转移。 背景技术 [0002]环状 RNA （circRNA） 是非编码  RNA 重要成员之一； 不同于线性长链非编码  RNA （lncRNA） ， circRNA  主要由 RNA 聚合酶 II 转录产生的前体  RNA 通过反向剪接产生的一 类不具有  5'末端帽子和  3'末端 poly(A) 尾巴结构， 却以共价键形成闭环结构的环状   RNA 分子。 。 circRNA参与调控一系列的疾病过程， 如心血管疾病、 神经系统疾病、 代谢性疾 病和肿瘤等疾病的发生和发展。 尤其在肿瘤中通过高通量测序技术筛选已经鉴定出大量与 肿瘤密切相关的  circRNA。 [0003]circRHOBTB3  是其母基因  RHOBTB3 第 6 和第 7 外显子背靠背反向剪接环化产 生， 目前有文献报道circRHOBTB3  的生物学功能通过分子海绵作用吸附  miR‑654‑3p 和调 控 PI3K/AKT  信号通路， 从而抑制胃癌和卵巢癌进展。 我们的前期实验也证明circRHOBTB3 可以通过别的机制抑制结直肠癌的进 展。 [0004]侵袭和转移是恶性肿瘤最普遍的生物学特征， 也是影响患者生存和预后的关键因 素， 结直肠癌不仅发病率高且在中晚期极易 发生转移， 成为治疗失败的主要原因。 目前并未 有针对circRHOBTB3的反义寡核苷酸 （Antisense  Oligonucleotide， ASO） 的产品及其在抑 制结直肠癌发生发展中的应用的相关研究。 发明内容 [0005]为了弥补现有技术中的不足， 本发明设计并合成了靶向circRHOBTB3的ASO药物， 可以有效提高circRHOBTB3在细胞中的水平。 用所述ASO处理结直肠癌细胞以及动物肿瘤转 移模型后， 有效抑制了结直肠癌细胞在体外的增殖、 迁移和侵袭以及在体内的转移， 为恶性 肿瘤的治疗提供了一条途径。 [0006]本发明的一个方面是提供circRHOBTB3的反义寡核苷酸ASO序列ASO ‑cir， 其可以 通过靶向circRHOBTB3的环化元件， 阻碍抑制性剪接因子的结合 从而提高circRHOBTB3表达 水平， 所述的ASO ‑cir包含如下序列： 5' ‑ GUUGCCTGAAGATTCATGGCUAGCA   ‑3'， 优选的， 所述 的ASO‑cir由序列5' ‑ GUUGCCTGAAGATTCATGGCUAGCA   ‑3'组成。 在一个具体的实施例中， 所 述的ASO‑cir被修饰， 所述的修饰包括但不限于5 ’及3’各5个碱基2 ’ ‑OMe修饰， 全链硫代磷 酸酯键修饰， 模式为MMMMMDDDDDDDDDDDDDDDMMMMM， 其中M代表2 ’ ‑OMe修饰的RNA， D表示未修 饰的DNA， 各碱基 （碱基 类似物） 由硫代磷酸酯键连接 。 [0007]本发明的第二个方面提供circRHOBTB3的反义寡核苷酸ASO序列ASO ‑exo， 其可以说　明　书 1/5 页 3 CN 113980967 A 3