(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111290859.7 (22)申请日 2021.11.02 (71)申请人 深圳先进技 术研究院 地址 518055 广东省深圳市西丽大 学城学 苑大道1068号 申请人 中国科学院深圳理工大 学 （筹） (72)发明人 万晓春　曹国政　 (74)专利代理 机构 北京中巡通大知识产权代理 有限公司 1 1703 代理人 王霞 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 5/10(2006.01)C12N 7/01(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 表达PD-L1单链抗体的靶向GPC3的嵌合抗原 受体、 T细胞及制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种表达PD ‑L1单链抗体的靶 向GPC3的嵌合抗原受体、 嵌合抗原受体T细胞及 制备方法和应用， 属于生物医药技术领域。 本发 明构建表 达PD‑L1单链抗体同时靶向GPC3的嵌合 抗原受体T细胞， 这种设计使得PD ‑L1单链抗体能 在局部肿瘤位点结合肿瘤细胞表达的PD ‑L1， 阻 断PD‑1/PD‑L1信号， 减弱T细胞耗竭， 增强CAR ‑T 细胞在体内外的抗肿瘤活性， 从而提高靶向GPC3 的嵌合抗原受体T细胞对肝细胞癌的治 疗效果。 权利要求书2页 说明书6页 序列表15页 附图1页 CN 113999319 A 2022.02.01 CN 113999319 A 1.一种表达PD‑L1单链抗体的靶向GPC3的嵌合抗原受体， 其特征在于， 该靶向GPC3的嵌 合抗原受体的氨基酸序列如SEQ  ID NO:1所示。 2.根据权利要求1所述的表达PD ‑L1单链抗体的靶向GPC3的嵌合抗原受体， 其特征在 于， 编码所述表达PD ‑L1单链抗体的靶向GPC3的嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ  ID NO:2 所示。 3.根据权利要求1所述的表达PD ‑L1单链抗体的靶向GPC3的嵌合抗原受体， 其特征在 于， 该表达PD ‑L1单链抗体的靶向GPC3的嵌合抗原受体包括从氨基端到羧基端依次连接的 靶向GPC3的单链抗体、 胞外铰链区、 跨膜区、 4 ‑1BB共刺激结构区、 CD3ζ信号结构区、 P2A、 IGHV3‑2信号肽、 靶向P D‑L1的单链抗体、 连接 子G4S、 标签蛋白的氨基酸序列。 4.根据权利要求3所述的表达PD ‑L1单链抗体的靶向GPC3的嵌合抗原受体， 其特征在 于， 所述靶向GPC3的单链抗体的氨基酸序列如SEQ  ID NO:3所示， 编码该靶向GPC3的单链抗 体的核苷酸序列如SEQ  ID NO:4所示。 5.根据权利要求3所述的表达PD ‑L1单链抗体的靶向GPC3的嵌合抗原受体， 其特征在 于， 所述胞外铰链区为CD8α 铰链区， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO:5所示， 编码该CD8α 铰链区 的核苷酸序列如SEQ  ID NO:6所示； 所述跨膜区为CD8α 跨膜区， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO: 7所示， 编码该CD 8α 跨膜区的核苷酸序列如SEQ  ID NO:8所示。 6.根据权利要求3所述的表达PD ‑L1单链抗体的靶向GPC3的嵌合抗原受体， 其特征在 于， 所述4‑1BB共刺激结构区的氨基酸序列包括如SEQ  ID NO:9所示的氨基酸序列； 所述4‑1BB共刺激结构区的编码基因包括如SEQ  ID NO:10所示的核苷酸序列； 所述CD3ζ信号结构区的氨基酸序列包括如SEQ  ID NO:11所示的氨基酸序列； CD3ζ信号结构区的编码基因包括如SEQ  ID NO:12所示的核苷酸序列。 7.根据权利要求3所述的表达PD ‑L1单链抗体的靶向GPC3的嵌合抗原受体， 其特征在 于， 所述P2A氨基酸序列如SEQ  ID NO:13所示； 编码P2A的核苷酸序列如SEQ  ID NO:14所示； 所述IGHV3‑2信号肽的氨基酸序列如SEQ  ID NO:15所示； 编码所述IGHV3 ‑2信号肽的核苷酸 序列如SEQ  ID NO:16所示。 8.根据权利要求3所述的表达PD ‑L1单链抗体的靶向GPC3的嵌合抗原受体， 其特征在 于， 所述靶向PD ‑L1的单链抗体的氨基酸序列如SEQ  ID NO:17所示； 编码所述靶向PD ‑L1的 单链抗体的核苷酸序列如SEQ  ID NO:18所示。 9.根据权利要求3所述的表达PD ‑L1单链抗体的靶向GPC3的嵌合抗原受体， 其特征在 于， 所述连接子G4S的氨基酸序列如SEQ  ID NO:19所示； 编码连接子G4S的核苷酸序列如SEQ   ID NO:20所示； 所述标签蛋白为6 ×His蛋白， 所述6 ×His蛋白的氨基酸序列如SEQ  ID NO: 21所示； 编码6 ×His蛋白的核苷酸序列如SEQ  ID NO:22所示。 10.一种靶向GPC3的嵌合抗原受体T细胞， 其特征在于， 包括权利要求1～9中任意一项 所述的表达P D‑L1单链抗体的靶向GPC 3的嵌合抗原受体。 11.一种靶向GPC 3的嵌合抗原受体T细胞的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)将表达PD ‑L1单链抗体的靶向GPC3的嵌合抗原受体CAR ‑CD276‑28BBζ 的编码基因插 入到pWPXLd载体中， 得到pWPXLd ‑GPC3CAR.T‑PD‑L1scFv重组质粒； 其中， 表达PD ‑L1单链抗体的靶向GPC3的嵌合抗原受体CAR ‑CD276‑28BBζ 的编码基因的 核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 113999319 A 22)将所述pWPXLd‑GPC3CAR.T ‑PD‑L1scFv重组质粒与包膜质粒、 包装质粒共转染宿主细 胞， 得到重组慢病毒； 3)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞， 经分离获得靶向GPC3的嵌合抗原受体T 细胞。 12.根据权利要求11所述的靶向GPC3的嵌合抗原受体T细胞的制备方法， 其特征在于， 步骤2)中， 所述包膜质粒为PMD2G， 所述包装质粒为psPAX2， 所述宿主细胞为HEK293T细胞； 步骤3)中， CD3阳性T淋巴细胞 是从人源外周血 单个核细胞中分离获得。 13.一种重组病毒载体， 其特征在于， 包含表达PD ‑L1单链抗体的靶向GPC3的嵌合抗原 受体GPC3CAR.T ‑PD‑L1scFv的编码基因， 该编码基因的核苷酸序列如SEQ  ID NO:2或SEQ  ID  NO:23所示。 14.根据权利要求13所述的重组病毒载体， 其特征在于， 所述表达PD ‑L1单链抗体的靶 向GPC3的嵌合抗原 受体GPC3CAR.T ‑PD‑L1scFv的编码基因， 自5 ’端到3’端依次由CD8α信号 肽的编码 基因、 靶向GPC3的单链 抗体的编码 基因、 CD8α 胞外铰链区的编码 基因、 CD8α 跨膜区 的编码基因、 4 ‑1BB共刺激结构区的编码基因、 CD3ζ信号结构区的编码基因、 P2A的编码基 因、 IGHV3 ‑2信号肽的编码基因、 靶向PD ‑L1的单链抗体的编码基因、 连接子G4S的编码基因 和标签蛋白6 ×His的编码基因串联相连； 其中： GPC3CAR.T‑PD‑L1scFv的氨基酸序列如SEQ  ID NO:24所示； CD8α 信号肽的编码基因的核苷酸序列如SEQ  ID NO:25所示； CD8α 信号肽的氨基酸序列如SEQ  ID NO:26所示。 15.权利要求1～9中任意一项所述的表达PD ‑L1单链抗体的靶向GPC3的嵌合抗原受体、 权利要求 10所述的靶向GP C3的嵌合抗原受体T细胞或权利要求 13所述的重组病毒 载体在制 备治疗肝癌的药物中的应用。 16.一种治疗肝细胞癌的药物， 其特征在于， 该药物包括权利要求1～9中任意一项所述 的表达PD ‑L1单链抗体的靶向GPC3的嵌合抗原受体、 权利要求10所述的靶向GPC3的嵌合抗 原受体T细胞或权利要求13所述的重组病毒载体。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 113999319 A 3