(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111355342.1 (22)申请日 2021.11.16 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 梁廷波　胡奇达　赵昕昱　王蒙　 邵世怡　黄珺明　 (74)专利代理 机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 林超 (51)Int.Cl. A61K 41/00(2020.01) A61K 9/50(2006.01) A61K 47/34(2017.01) A61K 47/46(2006.01)A61K 49/00(2006.01) A61K 49/22(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 5/10(2006.01) (54)发明名称 基因工程化肝癌靶向细胞膜仿生纳米微球 及其制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种基因工程化肝癌靶向细 胞膜仿生纳米微球及其制备方法。 为核壳结构， 外层壳为基因工程化过表达靶向跨膜蛋白的肝 癌细胞膜， 内层核为包载吲哚菁绿分子的聚乳 酸‑羟基乙酸共聚物纳米微球； 构建过表达靶向 跨膜蛋白的慢病毒， 构建过表达靶向跨膜蛋白的 肝癌细胞株， 慢病毒转染使肝癌细胞株表面出现 靶向跨膜蛋白， 分离和纯化过表达靶向跨膜蛋白 的肝癌细胞膜外壳， 包载吲哚菁绿分子的聚乳 酸‑羟基乙酸共聚物纳米微球制备， 基因工程化 过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜仿生纳米微 球制备。 本发 明产物有对肝癌组织大量精准递送 具有多模态成像和近红外光热效应的吲哚菁绿 分子， 能够实现肝癌诊 疗一体化的功能。 权利要求书2页 说明书5页 附图2页 CN 114225027 A 2022.03.25 CN 114225027 A 1.一种基因工程 化肝癌靶向细胞膜仿生纳米微球， 其特 征在于： 所述的纳米微球为核壳结构， 核壳结构的外层壳为过表达靶向跨膜蛋白(1 ‑1)的肝癌 细胞膜(1 ‑2)， 核壳结构的内层核为包载吲哚菁绿分子(1 ‑4)的聚乳酸 ‑羟基乙酸共聚物纳 米微球(1 ‑3)。 2.根据权利要求1所述的一种基因工程 化肝癌靶向细胞膜仿生纳米微球， 其特 征在于： 所述外层壳为基因工程化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜， 靶向跨膜蛋白的构 成为 IL‑2跨膜蛋白信号肽、 肝癌靶向肽SP94、 增强型绿色荧光蛋白EGFP、 3 ×FLAG标记蛋白、 糖基 化磷酯酰肌醇锚定蛋白GPI中的其中一种。 3.根据权利要求1所述的一种基因工程 化肝癌靶向细胞膜仿生纳米微球， 其特 征在于： 所述内层核为包载吲哚菁绿分子的聚乳酸 ‑羟基乙酸共聚物， 其中聚乳酸： 聚羟基乙酸 的摩尔比例为1： 1， 聚乳酸 ‑羟基乙酸共聚物与吲哚菁绿的质量比为5： 1～1： 5 。 4.根据权利要求1～3任一所述基因工程化肝癌靶向细胞膜仿生纳米微球的制备方法， 其特征在于所述制备 方法具体包括： 步骤一： 构建过表达靶向跨膜蛋白的慢病毒； 步骤二： 构建过表达靶向跨膜蛋白的标准肝癌细胞株， 且通过慢病毒转染使标准肝癌 细胞株表面出现靶向跨膜蛋白； 步骤三： 分离和纯化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜外壳； 步骤四： 包载吲哚菁绿分子(1 ‑4)的聚乳酸 ‑羟基乙酸共聚物纳米微球(1 ‑3)制备； 所述步骤四中， 使用0.22微米针式滤器过滤除去直径大于0.22微米的聚乳酸 ‑羟基乙 酸共聚物微球。 步骤五： 基因工程 化过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜仿生纳米微球制备。 5.根据权利要求 4所述制备 方法， 其特 征在于： 所述步骤二具体为： 将肝癌细胞铺到6孔板中， 37℃培养箱内常规培养24小时， 加入20微升/孔的过表达靶 向跨膜蛋白的慢病毒， 37℃培 养24小时得到过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞株。 6.根据权利要求 4所述制备 方法， 其特 征在于： 所述步骤三具体为： 由上述步骤二获得的肝癌细胞膜进行培养获得肝癌细胞膜， 收集肝癌细胞膜上稳定表 达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞， 使用含有质量分数为1％苯 甲基磺酰氟的细胞裂解液裂解细 胞， 于液氮和常温下反复冻结融化细胞 溶液， 再使用梯度离心法获得细胞膜； 最后经超声处理后使用脂质体挤出器挤过多孔聚碳酸酯多孔膜， 来回重复挤过膜3～ 11次， 获得 大小分布均一的过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜外壳。 7.根据权利要求 4所述制备 方法， 其特 征在于： 所述步骤四具体为： 使用超声细胞破碎仪， 将聚乳酸 ‑羟基乙酸共聚物的乙腈溶液逐滴加入吲哚菁绿的乙 醇溶液中超声处理10 分钟得到 混合溶液， 对混合溶液使用超 滤管离心去除游离吲哚菁绿分 子， 然后使用微米针式滤器过滤除处理获得聚乳酸 ‑羟基乙酸共聚物微球， 得到大小分布均 一的吲哚菁绿分子的聚乳酸 ‑羟基乙酸共聚物纳米微球。 8.根据权利要求 4所述制备 方法， 其特 征在于：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114225027 A 2所述步骤五具体为： 按照质量比1： 2～2： 1比例 混合过表达靶向跨膜蛋白的肝癌细胞膜外壳及吲哚菁绿分 子的聚乳酸 ‑羟基乙酸共聚物纳米微球， 超声处理后使用脂质体挤出器挤过200nm的聚碳酸 酯多孔膜， 来回重复挤过膜11次， 获得大小分布均一的基因工程化过表达靶向跨膜蛋白的 肝癌细胞膜仿生纳米微球。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114225027 A 3