ICS 67.120.30 B 50 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 2252—2014 水产品中孔雀石绿残留的检测—胶体金免 疫层析法 Detection of malachite green residue in aquatic products- Colloidal gold immunochromatographic method 文稿版次选择 2014 - 12 - 17 发布 安徽省质量技术监督局 2015 - 01 - 17 实施 发 布 DB34/T 2252—2014 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由合肥市渔政监督管理站提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：合肥市畜牧水产技术推广中心、合肥市渔业协会、杭州南开日新生物技术有限公 司。 本标准起草人：赖年悦、孙德祥、桑丽雅、周作友、徐薇、陈友顺、杨锐、曹海、张军、夏俊华、 陈元生、程定文、方凯、钱继银、桂淦、胡积清、戴靖、陈晓荣、徐丽、沈亭海、徐经云、洪家春。 I DB34/T 2252—2014 水产品中孔雀石绿残留的检测-胶体金免疫层析法 1 范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿（Malachite Green，MG）及其代谢物隐色孔雀石绿（Leucomalachite Green，LMG）残留的检测——胶体金免疫层析法的原理、试剂和材料、仪器和设备、测定步骤、结果判 断及表述、结果确证的方法。 本标准适用于鱼、甲鱼、龟肌肉组织和虾、蟹去壳、肠腺的可食用组织中孔雀石绿及其代谢物隐色 孔雀石绿残留的快速筛查检测。 本标准方法的检出限为：3.0 μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 本法为竞争抑制法，将氯金酸用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒，标记抗体。样品中残留的孔雀 石绿及其代谢物隐色孔雀石绿，以乙酸胺盐溶液和乙腈提取，正己烷净化，经四氯苯醌将隐色孔雀石绿 氧化成孔雀石绿，转入并溶解金标微孔内包被的抗孔雀石绿抗体和胶体金的结合物，再滴加到孔雀石绿 胶体金免疫快速检测试剂板的加样孔中，样品溶液以硝酸纤维素（NC）膜为载体，利用微孔膜的毛细管 作用缓慢向另一端渗移，在移动的过程中，样品溶液中的孔雀石绿与胶体金标记的特异性单克隆抗体结 合，从而抑制了抗体和检测线上特异性结合抗原的结合，未被孔雀石绿结合的抗体与检测线上的抗原反 应，并通过胶体金的颜色而显示出红色条带。用胶体金读卡仪或目测比较板/卡上控制线（C 线）和检 测线（T 线）上红色条带的有无及颜色的相对深浅进行判定。当样品中的孔雀石绿或隐色孔雀石绿含量 达到或超过本方法检出限时，检测线较控制线显色淡甚至无显色，判定为阳性。反之，当样品中的孔雀 石绿或隐色孔雀石绿含量在本方法检出限以下或无残留时，检测线与控制线显色一致或偏深，判定为阴 性。 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 试剂和材料 除特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的二级水。 对甲苯磺酸（C7H8O3S）。 盐酸羟胺（ClH4NO）。 乙酸铵（C2H7NO2）。 乙腈（C2H3N）。 中性氧化铝（Al2O3）：其悬浮液的 pH 为 7.5，层析用，100 目～200 目。 1 DB34/T 2252—2014 4.7 氯化钙（CaCl2）。 4.8 正己烷（C6H14）。 4.9 四氯苯醌（C6Cl4O2）：化学纯。 4.10 氢氧化钠（NaOH）。 4.11 乙酸胺盐溶液：称取对甲苯磺酸 5.16 g，盐酸羟胺 0.1 g，乙酸铵 0.2 g，加水溶解，定容至 500 mL，用 4 mol/L 4.10 氢氧化钠调 pH 至 4.5。 4.12 0.1％四氯苯醌溶液：溶解 0.1 g 四氯苯醌（4.9）于 80 mL 水中，加水定容至 100 mL。 4.13 孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂板。 4.13.1 孔雀石绿结合抗原：偶联率为 1:10 ～1:20（载体蛋白: MG）。 4.13.2 抗孔雀石绿抗体：多抗或单抗。多抗效价应大于 5 000（间接 ELISA 法），或有效抗体含量应 大于 0.05 mg/mL；特异性应大于 5 000（间接抑制 ELISA 法）。单抗效价应大于 15 000（间接 ELISA 法），或有效抗体含量应大于 0.5 mg/mL；特异性应大于 5 000（间接抑制 ELISA 法）。抗体相对亲和 力应大于 3.0×109（结合率下降 50％时，相对应的抗体浓度的倒数）。 4.13.3 样品垫：玻璃纤维或纸质薄片。 4.13.4 金标微孔：微孔底部包被有抗孔雀石绿抗体和胶体金的结合物。 4.13.5 NC 膜：4 cm 毛细管时间 121 s～149 s。 4.13.6 吸水垫：滤纸、玻璃纤维或吸水纸。 4.13.7 背衬：PVC。 4.13.8 塑料模板。 4.13.9 PBST 缓冲液。 4.13.10 储存与使用。密封包装，干燥阴凉处保存，用前恢复至室温，即开即用。 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 6 电子天平：感量 0.01 g。 均质机：转速≥8 000 r/min。 离心机：离心力≥3 000 g。 氮气或空气吹干仪：加热温度≥65℃。 pH 计：测量精度 ±0.02 pH 单位。 微量移液器：10 μL～100 μL，100 μL～1 000 μL。 胶体金读卡仪：测量精度±0.02 RLU（@ < 0.4 RLU）、±0.04 RLU（@ > 0.4 RLU）。 测定步骤 6.1 试样制备 鱼去鳞、去皮，取肌肉部分；甲鱼、龟取肌肉部分；虾、蟹去壳、肠腺，取可食部分。切成 0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的小块后混合，用均质机制成糜状。 6.2 提取 称取 5.0 g（±0.1 g）均质后的样品于 50 mL 离心管中，加入 3 mL 乙酸胺盐溶液、10 mL 乙腈， 剧烈振荡 3 min；加入 4 g 中性氧化铝（4.6），剧烈振荡 3 min；再加入 2 g 氯化钙，剧烈振荡 1 min， 3 000 g 离心 5 min。移取 5 mL 上清液于另一离心管中，加入 1 mL 正己烷，剧烈振荡，3 000 g 离 2 DB34/T 2252—2014 心 1 min；移取 4 mL 下层溶液于 5 mL 离心管中，加入 0.1 mL 0.1％四氯苯醌溶液（4.12），摇匀， 65℃氮气或空气吹干；用 0.3 mL PBST 缓冲液（4.13.9）溶解残留物，静置 2 min，待测。 6.3 测定 6.3.1 取出孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂板（4.13），使用前恢复至室温，置于水平台面上。吸 取待测样品溶液 100 µL 于金标微孔中，轻微摇动直至孔内红色物质完全溶解，静置 5 min，吸取金 标微孔内溶液滴加到快速检测试剂板的加样孔中，在 8 min～10 min 内目测或通过胶体金读卡仪读取 结果。 6.3.2 空白对照：每批样品需做一孔空白对照，以 PBST 缓冲液（4.13.9）代替试样提取液，按 6.3.1 进行。 6.3.3 平行测定：每个样品的平行样数量≥2；分别按 6.2 和 6.3.1 进行。 注：不同试剂板制造商的产品组成和操作会有细微的差别，应严格按说明书要求规范操作。 7 结果判断及表述 7.1 试剂板有效性判定 7.1.1 失效检测试剂板：空白对照控制线（C 线）不出现红色条带（如图 1），则检测试剂板失效，不 能进行检测。 7.1.2 有效检测试剂板：空白对照控制线（C 线）和检测线（T 线）均出现红色条带，且 T 线比 C 线颜 色深或一样深（如图 2），则检测试剂板有效，可进行检测。 7.2 结果及表述 7.2.1 阴性：试样检测线（T 线）出现红色条带，且颜色比控制线（C 线）深或一样深（如图 2），结 果为阴性，孔雀石绿残留量< 3.0 μg/kg）。 7.2.2 阳性：试样检测线（T 线）出现红色条带，但颜色比控制线（C 线）浅或检测线（T 线）未出现 红色条带（如图 3），结果为阳性（孔雀石绿残留量≥3.0 μg/kg）。 8 结果确证 本方法检测结果为阳性的样品，需用现行有效的 LC-MS/MS 方法进行确证。 _________________________________ 3