ICS 65.120 B 46 重 DB50 庆 市 地 方 标 准 DB50/T 953—2019 饲料中大肠杆菌 O157 的快速检测 环介导等温扩增（LAMP）法 Rapid determination of Escherichia coli O157 in feeds ——Loop-mediated isothermal amplification detection method 2019-12-12 发布 重庆市市场监督管理局 2020-03-15 实施 发 布 DB50/T 953-2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由重庆市农业农村委员会提出并归口。 本标准起草单位：重庆市动物疫病预防控制中心，重庆市兽药饲料检测所。 本标准主要起草人员：胡健、周莉、侯亚莉、朱英才、盛欣、丁平、何义刚、张毅、王美珍、张军 等。 I DB50/T 953-2019 饲料中大肠杆菌 O157 的快速检测方法 环介导等温扩增（LAMP）法 1 范围 本标准规定了用环介导等温扩增（LAMP）法检测饲料中大肠杆菌 O157 的原理、试剂、仪器和设 备、操作步骤、结果判定和表述。 本标准适用于饲料中大肠杆菌 O157 的筛选检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.36 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌 O157 :H7/NM 检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 生物安全措施 培养物和废弃物处理应按照GB 19489的规定执行。 4 原理 用热裂解法提取大肠杆菌O157的基因组DNA作为环介导等温扩增模板，根据大肠杆菌O157的rfbE 基因特异序列，设计5条LAMP引物(参见附录A），建立LAMP反应体系，恒温反应结束后根据添加的 染料显色情况进行结果判断。 5 试剂 5.1 除另有规定外，试剂为分析纯试剂，试验用水符合 GB/T 6682 的要求。 5.2 改良 EC 肉汤（mEC+n）。 5.3 营养肉汤。 5.4 生理盐水。 5.5 双蒸水（ddH2O）。 5.6 合成大肠杆菌 O157 检测用引物，包括外引物一对，内引物一对，环状下游引物一条。外引物 F3： 5’-TCTCAATTCTAACTAGGACCGCAGA-3’；外引物 B3：5’-ATAACTTGCTCATTCGATAGGCTGG-3’； 内引物 FIP：5’-ACAGGGTAAAAAACTGGCCTGAGGAATTAAGGAATCACCTTGC-3’；内引物 BIP： 5’-CACGATGCCAATGTACTCGGAAAAATAATTCCACGCCAACCAAGA-3’；环状下游引物 LB： 5’-ATCAAAAGCACCCTATAGCTGAG-3。将各引物用双蒸水溶解，配置成 100 mmol/L 的储备浓度， 用双蒸水稀释为 10 mmol/L 工作浓度备用。 5.7 Bst DNA 聚合酶。 5.8 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPS），包括 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 10 mmol/L。 5.9 MgCl2 溶液（50 mmol/L）。 5.10 10×Bst DNA 聚合酶缓冲液（200 mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、100 mmol/L KCl、100 mmol/L (NH4)2SO4、20 mmol/L MgSO4、1% Triton X-100）。 5.11 甜菜碱，用双蒸水溶解，配置成 5 mol/L 溶液。 1 DB50/T 953-2019 5.12 钙黄绿素 C46H46N2O23，用双蒸水溶解，配置成 625μmol/L 溶液。 5.13 MnCl2，用双蒸水溶解，配置成 7.5 mmol/L 溶液。 5.14 阳性对照：大肠杆菌 O157 标准菌株基因组 DNA。 6 仪器和设备 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 移液器，量程为 0.5μL~10μL，10μL~100μL，量程 100μL~1000μL。 无菌均质袋，500mL。 锥形瓶，500mL。 水浴锅或恒温金属浴，精度±1℃。 高速离心机，≥7000 g。 恒温培养箱，精度±1℃。 电子天平：感量 0.01g、感量 0.0001g。 7 采样 7.1 采样原则 样品的采集应遵循随机性、代表性的原则。采样过程应遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污 染。 7.2 采样方法 7.2.1 应在同一批次产品中采集样品，每件样品的采样量应满足微生物指标检验的要求，一般不少于 500g（mL）。 7.2.2 独立包装不大于 500g 的固态产品或不大于 500mL 的液态产品，取完整包装。 7.2.3 独立包装大于 500mL 的液态产品，应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均匀后采集 适量样品，放入无菌采样容器内作为一个样品。 7.2.4 独立包装大于 500g 的固态产品，应用无菌采样器从同一包装的不同部分分别采取适量样品，放 入同一个无菌采样容器内作为一件样品。 7.3 采集样品的贮存和运输 7.3.1 应尽快将样品送往实验室检验。 7.3.2 应在运输过程中保持样品完整。 7.3.3 应在接近原有贮存温度条件下贮存样品，或采取必要措施防止样品中微生物数量的变化。 8 操作步骤 8.1 样品制备、增菌培养 称取25 g样品（精确至0.01g），加入装有225 mL改良EC肉汤的500 mL锥形瓶或无菌均质袋内，混 匀后在36℃±1℃恒温培养箱内培养18 h~24 h。 8.2 大肠杆菌 O157 模板 DNA 的提取 取1 mL8.1得到的增菌液，7000 g离心1 min，弃掉上清液；加入500 mL ddH2O悬浮沉淀，7000 g离 心1 min，弃掉上清液，重复一次；用100μL ddH2O悬浮沉淀后放置于100℃水浴锅中煮沸10 min，7000 g 离心1 min，取上清液，-20 ℃保存3个月备用。DNA提取也可用等效的商品化DNA提取试剂盒，按照其 说明提取制备大肠杆菌O157基因组DNA。 2 DB50/T 953-2019 8.3 环介导等温扩增 8.3.1 反应体系 在200μL的PCR反应管中依次加入10×Bst DNA聚合酶缓冲液2.5μL、dNTPs 1.5μL、MgCl2 1.25 μL、引物溶液（外引物、内引物、环引物分别加入0.25μL、2μL、1μL）、模板DNA 2μL、Bst DNA 聚合酶1μL、甜菜碱4μL、MnCl2 1μL、钙黄绿素1μL，加入ddH2O补足25μL。 8.3.2 反应过程 在63℃（±1℃）水浴锅或金属浴中放置50 min。 8.4 空白对照、阴性对照、阳性对照设置 试样检测过程应同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照。阴性对照为经确证无大肠杆菌O157的 饲料，按8.1～8.3步骤操作；空白对照设为以水替代DNA模板，按照8.3步骤操作；阳性对照为大肠杆菌 O157标准菌株接种于营养肉汤在36℃±1℃培养18 h~24 h后，用无菌生理盐水稀释至约106 CFU/mL至 108 CFU/mL（约麦氏浊度0.4），按8.2提取基因组DNA作为模板，按8.3步骤操作。 8.5 结果观察 反应结束后，将反应管取出观察显色情况（不开盖）。 9 结果判定和表述 9.1.1 在空白对照管和阴性对照管反应液呈橙色，阳性对照管反应液呈绿色的情况下，检测条件成立， 反之本次实验无效。 9.1.2 样品反应管中液体呈橙色，可报告 25 g 饲料中未检出大肠杆菌 O157；样品反应管中液体呈绿 色，说明 25 g 饲料中大肠杆菌 O157 初步筛选为阳性，需要对样品增菌液进一步按 GB 4789.36 中操作 步骤进行确认后报告结果。 3 DB50/T 953-2019 附录A (资料性附录) 大肠杆菌0157靶基因序列 A.1 大肠杆菌 O157 靶基因序列（accession no AF16332.1） TCTCAATTCT AACTAGGACC GCAGAGGAAA GAGAGGAATT AAGGAATCAC CTTGCAGATA AACTCATCGA AACAAGGCCA GTTTTTTACC CTGTCCACAC GATGCCAATG TACTCGGAAA AATATCAAAA GCACCCTATA GCTGAGGATC TTGGTTGGCG TGGAATTAAT TTACCTAGTT TCCCCAGCCT ATCGAATGAG CAAGTTAT ___________________ 4