DB 43 ICS 01.040.85 Y32 湖 南 省 地 方 标 准 DB43/T 1657—2019 洞庭湖荻苇中不可溶性糖含量的测定 液相 色谱法 Determination of insoluble saccharides of reeds in Dongting Lake Liquid chromatography 2019 - 09 - 16 发布 湖南省市场监督管理局 2019 - 12 - 16 实施 发 布 DB43/T 1657—2019 目 前 次 言 ............................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语及定义 ........................................................................ 1 4 原理 .............................................................................. 1 5 仪器和试剂 ........................................................................ 1 6 样品准备 .......................................................................... 2 7 高效液相色谱仪操作条件 ............................................................ 2 8 试验步骤 .......................................................................... 3 9 结果报告 .......................................................................... 4 10 试验报告 ......................................................................... 4 I DB43/T 1657—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则编写。 本标准起草单位：常德市产商品质量监督检验所/国家生活用纸质量监督检验中心。 本标准主要起草人：彭小悦、郭盛、孙华、罗云鹰、张乐华 、代泳波。 本标准由湖南省生活用纸标准化技术委员会归口。 本标准为首次发布。 II DB43/T 1657—2019 洞庭湖荻苇中不可溶性糖含量的测定 液相色谱法 1 范围 本标准规定了测定洞庭湖荻苇原料中不可溶性糖含量的测定方法和规范。 本标准适用于不含抽提物的荻苇原料。对于未经处理的含有抽提物的荻苇原料样品，必须事先去除 样品中的抽提物才能进行分析。本标准同样适用于酸或碱处理后（洗涤至不含残余酸或碱）以及发酵剩 余物质中固体样品的不可溶性糖含量测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 2677.1 造纸原料用分析试样的采取 GB/T 2677.2 造纸原料水分的测定 GB/T 2677.5 造纸原料有机溶剂抽出物含量的测定 3 术语及定义 3.1 新鲜荻苇原料 当年现场取用的荻苇原料。 3.2 绝干质量 不含水的生物质原料质量，按照GB/T 2677.2标准方法所述步骤在105℃烘干获得。 3.3 准备好的生物质样品 根据GB/T 2677.1标准方法处理得到的固体含量大于85%的生物质样品。 3.4 不含抽提物的生物质样品 根据GB/T 2677.5标准方法处理得到的不含有抽提物的样品，该方法可去除荻苇原料中包括可溶性 糖在内的各种可溶性组分。 4 原理 荻苇原料中的不可溶性糖，通过两段硫酸水解后可转化为其相对应的单糖。采用高效液相色谱检测 水解液中的单糖含量后，通过计算可得到生物质原料中的不可溶性糖。 5 仪器和试剂 1 DB43/T 1657—2019 5.1 仪器和材料 5.1.1 分析天平：读数精度 0.1mg； 5.1.2 高压反应器：控温要求 121 ± 3℃； 5.1.3 水浴锅：控温要求 30 ± 1℃； 5.1.4 鼓风干燥箱：控温要求 45 ± 3℃、105 ± 3℃； 5.1.5 干燥器：装有无水硫酸钙或其它干燥剂； 5.1.6 高效液相色谱：配备示差折光检测器； 5.1.7 进样瓶； 5.1.8 一次性注射器（1mL 和 3mL）； 5.1.9 一次性水相滤头（0.22μm）； 5.1.10 玻璃血清瓶(125mL) 具备耐腐蚀性的橡胶密封塞（如有聚四氟乙烯覆膜层）和铝制密封圈。也可用其它具有耐高温、耐 高压、耐腐蚀性的可严密密封的容器取代。 5.1.11 称量纸； 5.1.12 玻璃试管（16×100mm）； 5.1.13 锥形瓶（容积 50mL）； 5.1.14 pH 试纸。 5.2 试剂 除非特别说明，本标准所用试剂均为分析纯试剂。所用水的纯度必须满足实验室用水二级水的标准。 5.2.1 碳酸钙 5.2.2 高纯度标准品（≥98%）： 葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖，均在 45 ±3℃下烘干至恒重。 5.2.3 浓硫酸 5.2.4 稀硫酸（72%w/w 或 12.00 ± 0.02mol/L）： 在冰浴及充分搅拌的条件下，缓缓将665mL的浓硫酸（5.2.4）加入至300mL水中；将溶液温度调整 至20℃，并将其相对密度调整至1.6338。 6 样品准备 按照GB/T 2677.1标准方法，将新鲜的生物质原料样品进行干燥、粉碎、筛分，得到准备好的生物 质原料样品；然后，依照GB/T 2677.5所述标准步骤对准备好的生物质原料样品进行抽提，去除其含有 的抽提物，经干燥后得到不含抽提物的生物质原料样品。 7 高效液相色谱仪操作条件 2 DB43/T 1657—2019 以HP Model 1090型高效液相色谱仪（含示差折光检测器） 、BioRad Aminex HPX-87C或HPX-87P型色 谱柱（配备合适的保护柱）为例，其操作条件为：进样体积50μL，淋洗液为去离子水（氦气或真空脱 气、电阻18M欧姆、0.2μm滤膜过滤） ，柱流量0.6mL/min，柱温85℃，数据采集20分钟、后运行15分钟。 8 试验步骤 8.1 标准曲线 8.1.1 标准溶液配制 分别准确称取4.0g的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖，溶解至1L的超纯水中，配制成浓 度为4.0g/L的混合糖标准溶液，并用一次性0.22μm水相滤头将其过滤。将该标准溶液按照相应比例进行 稀释，分别得到7个水平（0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0g/L）的混合糖标准溶液。 8.1.2 高效液相色谱检测 对于具有自动进样器的高效液相色谱仪，用移液枪移取约1.5mL的上述七个水平的混合糖标准溶液、 并分装至进样瓶中，进行糖含量检测。对于需要手动进样的高效液相色谱仪，用一次性注射器移取约1mL 的混合糖标准溶液，打入手动进样阀的阀口、进行糖含量检测。记录不同浓度下各种糖的液相色谱信号 值。 8.1.3 建立标准工作曲线 分别以五种糖的浓度为横坐标、液相色谱信号值为纵坐标做图，并利用线性回归工具拟合图中数据 点，得到各种糖的标准工作曲线，即： cn = kn An +bn （1） 式中：n —— 糖种类标识； cn—— 某糖在溶液中的浓度（g/L） ； An—— 某糖的液相色谱信号值； kn—— 某糖标准工作曲线的斜率（g/L） ； bn—— 某糖标准工作曲线的截距（g/L） 。 8.2 荻苇样品处理及检测 8.2.1 72%硫酸预水解 准确称取300 ± 10mg不含抽提物的粉状生物质原料、重量精确至0.1mg。将称量好的不含抽提物的 粉状生物质原料转移至玻璃试管中，准确加入3.00 ± 0.01mL（4.92 ± 0.01g）72%硫酸，并用搅动至固液 完全混合。将该试管放入30 ± 1℃的水浴锅中，水解时间为1小时；为了确保样品完全混合、润湿，每隔 15分钟搅动一次。 8.2.2 水解产物稀释 将按照8.2.1处理后的全部水解产物转移至玻璃血清瓶中，使用84.00 ± 0.04 mL的水将其稀释至硫酸 浓度4%w/w。在转移、稀释过程中，可采用多次洗涤的方式将所有水解后固体及水解液转移至玻璃血 清瓶，由此获得的水解产物稀释液、其总重应为89.22g或总体积87mL。将装有稀释好的水解产物的玻 璃血清瓶用橡胶塞和铝盖密封。 3 DB43/T 1657—2019 8.2.3 高温水解 将8.2.2所述密封好的玻璃血清瓶放入高压反应器内，在121 ± 3℃下水解1小时。水解完成后，将玻 璃血清瓶取出、在室温下冷却20分钟。 8.2.4 水解液中和与过滤 将玻璃血清瓶的密封铝盖及橡胶塞打开，移取20mL的水解液至50mL的锥形瓶中；将碳酸钙缓缓加 至瓶中，用pH试纸检测水解液pH值、直至溶液pH值在5~6之间为止，切不可过度中和至pH值高于6。为 了避免产生泡沫及由于液体过热产生水蒸气而导致的水损失，碳酸钙加入速度一定要缓慢。用3mL的一 次性注射器吸取上清液，然后配合一次性0.22μm水相滤头将其过滤至进样瓶中。如糖浓度过高，可将 滤液按需求进行稀释（稀释比例记为D） ，再加入至进样瓶中。 8.2.5 水解液糖含量测定 按照8.1.2检测水解液或其稀释液中的糖含量，记录各种糖的检测信号An,0。 9 结果报告 9.1 荻苇样品中糖含量的计算 以绝干原料计，荻苇样品中的糖含量可用下式计算 cn , 0 = Dw1 (k n An ,0 +bn )  87.0  100% m1  Rn （3） 式中：n —— 糖种类标识； cn,0 —— 荻苇原料中某糖的含量（%） ； D —— 水解液检测前的稀释倍数（8.2.4） ； An,0 —— 荻苇原料水解后的待测液中某糖