ICS 65.120 CCS B 46 湖 42 北 省 地 方 标 准 DB42/T 1582—2020 饲料中牛、羊源性成分定性 PCR 检测方法 Detection of bovine, ovine, caprine derived materials in feedstuffs by qualitative polymerase chain reaction (PCR) method 2020 - 07 - 07 发布 湖 北 省 市 场 监 督 管 理 局  发 布 2020 - 11 - 07 实施  FORMTEXT  DB42/T   目 FORMTEXT  1582 — FORMTEXT  2020 次 前言....................................................................................................................................................................... II 1 范围................................................................................................................................................................... 1 2 规范性引用文件............................................................................................................................................... 1 3 术语和定义....................................................................................................................................................... 1 4 原理................................................................................................................................................................... 1 5 试剂和材料....................................................................................................................................................... 1 6 仪器和设备....................................................................................................................................................... 2 7 分析步骤........................................................................................................................................................... 3 8 结果分析........................................................................................................................................................... 5 9 结果判定与表述............................................................................................................................................... 5 10 PCR 产物测序结果判定与表述......................................................................................................................5 11 检测过程中防止交叉污染的措施.................................................................................................................5 12 废弃物处理..................................................................................................................................................... 5 附录 A（资料性） 扩增产物序列（来源 NCBI）............................................................................................ 6 I  FORMTEXT  DB42/T   FORMTEXT  1582 — 前 FORMTEXT  2020 言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由华中农业大学提出。 本文件由湖北省农业农村厅归口。 本文件起草单位：华中农业大学、湖北省畜禽产品质量监督检验测试中心。 本文件主要起草人：刘榜，王文君，刘祖红，金秀娥，付明，周翔，梁昱，王峻。 本文件实施中的疑问可咨询湖北省农业农村厅，联系电话：027-87665821，邮箱：[email protected]； 华中农业大学，联系电话：027-87382290，邮箱：[email protected]。 对 本 文 件 的 有 关 修 改 意 见 及 建 议 请 华 中 农 业 大 学 ， 联 系 电 话 ： 027-87282038 ， 邮 箱 ： [email protected]。 II  FORMTEXT  DB42/T   FORMTEXT  1582 — FORMTEXT  2020 饲料中牛、羊源性成分定性 PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了饲料中除乳制品以外的牛（普通牛、瘤牛、牦牛和水牛）、羊（绵羊和山羊）源性成 分的定性PCR检测方法。 本文件适用于饲料中除乳制品以外的牛（普通牛、瘤牛、牦牛和水牛）、羊（绵羊和山羊）源性成 分的定性PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 27403-2008 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 根据牛、羊特异性序列，设计一对特异性引物，对待检样品提取的DNA进行PCR扩增，依据扩增特异 性片段的结果，判断待检样品中是否含有牛或羊源性成分，并可根据片段大小差异进而判断是牛源性成 分（125 bp），还是羊源性成分（107 bp）。 5 试剂和材料 5.1 5.2 5.3 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。 琼脂糖。 GelRed 核酸染料。 注：根据需要可选择其他效果相当的核酸染料作为核酸电泳的染色剂。 5.4 10 mol/L 氢氧化钠溶液：在 160 mL 水中加入 80.0 g 氢氧化钠（NaOH），溶解后冷却至室温，再 加水定容至 200 mL。 1  FORMTEXT  DB42/T   FORMTEXT  1582 — FORMTEXT  2020 5.5 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0）：称取 18.6 g 乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2），加 入 70 mL 水中，再加入适量氢氧化钠溶液（5.4），加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液 （5.4）调 pH 至 8.0，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa（121 ℃）条件下灭菌 20 min。 5.6 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH 8.0）：称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解 于 800 mL 水中，用盐酸（HCl）调 pH 至 8.0，加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121 ℃）条件下 灭菌 20 min。 5.7 5 mol/L 氯化钠溶液：称取 29.22 g 氯化钠（NaCl）溶于 80 mL 水中，加水定容至 100 mL。在 103.4  kPa 蒸汽压（121 ℃）条件下灭菌 20 min。 5.8 10%十二烷基磺酸钠溶液：称取 10 g 十二烷基磺酸钠（C12H25SO4Na，SDS），加入 80 mL 水中，加 热至完全溶解后，冷却至室温，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa 蒸汽压（121 ℃）条件下灭菌 20 min。 5.9 DNA 提取细胞裂解液：量取 200 mL 乙二铵四乙酸二钠溶液（5.5），200 mL 三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液（5.6），40 mL 氯化钠溶液（