(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210927875.0 (22)申请日 2022.08.03 (71)申请人 大连医科 大学附属第二医院 地址 116000 辽宁省大连市沙河口区中山 路467号 (72)发明人 李先承　范博　马爽　杜晓慧　 王炜　沈宸　王小刚　陈志岐　 (74)专利代理 机构 大连至诚专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 21242 专利代理师 杨威　李永旭 (51)Int.Cl. C12M 1/00(2006.01) B01L 3/00(2006.01) C12N 5/09(2010.01) C12N 5/071(2010.01) (54)发明名称 一种用于模拟体内肾癌细胞及其转移微环 境的仿生 微流控芯片及其制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于模拟体内肾癌细胞 及其转移微环境的仿生微流控芯片及其制备方 法， 其结构包括： 第一层PDMS基片、 第二层PDMS基 片和第三层PDMS基片， 第一层PDMS基片上设有进 样孔和废液池， 第二层PDMS基片上设有间质微环 境， 第三层PDMS基片上设有三个单元： 肾癌原发 灶单元、 血管单元和转移灶单元； 其中进样孔连 接各单元的上端， 废液池连接各单元的下端， 各 单元在结构上相互独立但可通过间质通道相互 扩散细胞因子； 芯片制备方法为： 首先制备含有 微结构的S U‑8阳模， 然后以PDMS为原料在S U‑8模 板表面上制备PDMS基片， 最后将三个PDMS基片 按 顺序封接制成仿生微流控芯片。 本发 明将仿生肾 癌芯片与仿生靶器官芯片相结合， 能够有效检测 并模拟肾癌细胞转移过程， 实用性较强。 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 115044452 A 2022.09.13 CN 115044452 A 1.一种用于模拟体 内肾癌细胞及其转移微环境的仿生微流控芯片， 其特征在于， 包括： 第一层PDMS基片(1)、 第二层P DMS基片(2)和第三层P DMS基片(3)； 所述第一层PDMS基片(1)为顶层， 第一层PDMS基片(1)的一侧依次设有第一进样孔 (11)、 第二进样孔(12)、 第三进样孔(13)、 第四进样孔(14)和第五进样孔(15)， 另一侧依次 设有第一废液池(16)、 第二废液池(17)、 第三废液池(18)、 第 四废液池(19)和第五废液池 (20)； 所述第二层PDMS基片(2)为中间层， 第二层PDMS基片(2)上设有间质微环境(21)， 所述 间质微环境(21)包括第一间质通道(21 1)和第二间质通道(212)； 所述第三层PDMS基片(3)为底层， 第三层PDMS基片(3)包括： 肾癌原发灶单元(31)、 血管 单元(32)和转移灶单 元(33)； 所述第一进样孔(11)与所述肾癌原 发灶单元(31)上端连接， 所述第一废液池(16)与肾 癌原发灶单 元(31)下端连接； 所述第二进样孔(12)与所述第一间质通道(211)上端连接， 所述第二废液池(17)与第 一间质通道(21 1)下端连接； 所述第三进样孔(13)与所述血管单元(32)上端连接， 所述第三废液池(18)与血管单元 (32)下端连接； 所述第四进样孔(14)与所述第二间质通道(212)上端连接， 所述第四废液池(19)与第 二间质通道(212)下端连接； 所述第五进样孔(15)与所述转移灶单元(33)上端连接， 所述第五废液池(20)与转移灶 单元(33)下端连接； 所述第三层PDMS基片(3)上的肾癌原发灶单元(31)通过所述第一间质通道(211)与所 述血管单元(32)连接， 所述血管单元(32)通过所述第二间质通道(212)与所述转移灶单元 (33)连接。 2.根据权利要求1所述的一种用于模拟体内肾癌细胞及其转移微环境的仿生微流控芯 片， 其特征在于， 所述进样口、 废液池的开口横截面均为 等径的圆形， 直径范围为8 ‑10mm。 3.根据权利要求1所述的一种用于模拟体内肾癌细胞及其转移微环境的仿生微流控芯 片， 其特征在于， 所述肾癌原发灶单元(31)、 血管单元(32)和转移灶单元(33)的截面均为相 同的矩形， 单元凹槽的长为35 ‑40mm， 宽为8 ‑10mm， 高为4 ‑6mm； 三个单元在结构上相互平行 且相互独立， 但可通过间质微环境(21)使化学因子或细胞因子在各 单元之间相互扩散 。 4.基于权利要求1至3任意一项所述的一种用于模拟体内肾癌细胞及其转移微环境的 仿生微流控芯片的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤1、 制备含有微 通道和微结构的微 流控芯片的SU ‑8阳模； 步骤2、 以SU ‑8阳模为模板， 以PDMS为复制原料， 制备所述第一层PDMS基片(1)、 第二层 PDMS基片(2)、 第三层P DMS基片(3)； 步骤3、 将第一层PDMS基片(1)、 第二层PDMS基片(2)和第三层PDMS基片(3)依次放置并 封接； 步骤4、 将细胞培 养后通过进样孔接种进微 流控芯片。 5.根据权利要求4所述的一种用于模拟体内肾癌细胞及其转移微环境的仿生微流控芯 片的制备 方法， 其特 征在于， 所述 步骤1包括以下步骤：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115044452 A 2步骤1.1、 使用设计软件CAD绘制微 流控芯片中的微 通道和微结构； 步骤1.2、 将绘制图打印在SU ‑8胶片上形成掩膜； 步骤1.3、 采用标准 光刻工艺制成SU ‑8模具。 6.根据权利要求4所述的一种用于模拟体内肾癌细胞及其转移微环境的仿生微流控芯 片的制备 方法， 其特 征在于， 所述 步骤2包括以下步骤： 步骤2.1、 将SU ‑8模具放置在真空环境 中， 将PDMS和固化剂按质量比10： 1混匀并浇涂在 模具表面， 80℃的环境下烘烤 模具一小时； 步骤2.2、 将SU ‑8模具冷却后缓慢将PDMS从模具表面上撕下， 在第一层PDMS基片(1)上 钻出进样孔、 废液池和间质通道； 步骤2.3、 对第三层PDMS基片(3)进行区室化设计， 划分出三个结构单元： 肾癌原发灶单 元(31)、 血管单元(32)和转移灶单元(33)， 使各单元结构相互独立并可通过间质通道相互 联系； 步骤2.4、 将第一层PDMS基片(1)、 第二层PDMS基片(2)和第三层PDMS基片(3)进行切割， 尺寸为： 长55‑60mm， 宽40‑45mm， 高4‑6mm。 7.根据权利要求4所述的一种用于模拟体内肾癌细胞及其转移微环境的仿生微流控芯 片的制备 方法， 其特 征在于， 所述 步骤4包括以下步骤： 步骤4.1、 间质细胞的接种： 将制作完成的PDMS 芯片高压灭菌后， 置于冰盒上， 将间质细 胞溶液消化、 离心后加入BME培养基重悬， 反复吹打后通过第二进样孔(12)或第四进样孔 (14)加入到基质通道内， 显微镜下调整细胞密度至3.15 ×104个细胞/cm2后， 将芯片放入37 ℃、 5％CO2浓度的孵箱中培 养过夜； 步骤4.2、 微流控芯片中HK ‑2细胞的接种： 待HK ‑2细胞达到90％融合度后消化细胞， 将 HK‑2细胞溶液进 行离心重悬后吹打为单个细胞悬液， 然后通过第一进样孔(11)将 HK‑2细胞 悬浮液均匀加入至细胞培养小室内， 显微镜下调整细胞密度至2.5 ×105个细胞/cm2后， 将 芯片放入37℃、 5％CO2浓度的孵箱中侧立30 分钟使HK ‑2细胞与BME培养基粘附， 然后平 放培 养过夜； 步骤4.3、 微流控芯片中肾癌细胞的接种： 将处于对数生长期的肾癌细胞786 ‑O用浓度 为0.25％的胰酶消化， 在800rpm转速下离心5分钟， 弃去上清液， 再用1640培养液吹打细胞 将细胞密度调整至1 ×106个细胞/mL， 通过肾癌原发灶单元(31)的进样池将786 ‑O细胞悬浮 液均匀加入细胞培养小室内， 并将芯片放入37℃、 5％CO2浓度的孵箱中侧立30分钟使786 ‑O 细胞与BM E培养基粘附， 然后平放培 养过夜； 步骤4.4、 血管内皮细胞的接种： 待血管内皮细胞达到90％融合度后， 消化细胞并将溶 液离心重悬后吹打为单个细胞悬液， 通过第三进样孔(13)将血管内皮细胞悬浮液均匀加入 至细胞培养小室内， 显微镜下调整细胞密度至7.5 ×103个细胞/cm2后， 将芯片放入37℃、 5％CO2浓度的孵箱中培 养过夜； 步骤4.5、 转移器官细 胞的接种： 将FOB细 胞系或BEAS ‑2B细胞系消化后将细 胞溶液离心 重悬后吹打为单个细胞悬液， 通过第五进样孔(15)将细胞悬浮液均匀加入至细胞培养小室 内， 在显微镜下将细胞密度调整至104个细胞/cm2后， 将芯片放入37℃、 5％CO2浓度的孵箱 中侧立30分钟使FOB 细胞或BEAS ‑2B细胞与BM E培养基粘附， 然后平放培 养过夜。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115044452 A 3