(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211172040.5 (22)申请日 2022.09.26 (71)申请人 华南理工大 学 地址 510641 广东省广州市天河区五山路 381号 (72)发明人 付晓玲　刘笑冰　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 专利代理师 梅素丽 (51)Int.Cl. C12N 5/0775(2010.01) A61K 35/28(2015.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 17/02(2006.01) A61P 19/04(2006.01)A61P 19/08(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 39/06(2006.01) (54)发明名称 一种基于脱核干细胞的促修复微囊泡及其 制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种基于脱核干细胞的促修 复微囊泡及其制备方法和应用， 包括如下步骤： 使用细胞松弛素B对干细胞进行脱核， 利用 Percoll离心法或涡旋法分离 出脱去细胞核的干 细胞胞质体， 使用带有滤膜的挤出装置反复挤 出， 即得脱核干细胞微囊泡。 本发明中的方法在 除去了干细胞的细胞核的同时保留了干细胞发 挥促修复功能的关键蛋白质和RNA， 降低了危险 基因转移的风险。 而且基于挤出法能够有效控制 微囊泡的粒径分布， 而且基于滤膜的孔径大小， 灵活调整所制备的微囊泡的大小， 并在组织损伤 等方面具有显著治 疗效果。 权利要求书1页 说明书6页 附图5页 CN 115537386 A 2022.12.30 CN 115537386 A 1.一种脱 核干细胞微囊泡的制备 方法， 包括如下步骤： 使用细胞松弛素B对干细胞进行脱核， 利用Percoll离心法或涡旋法分离出脱去细胞核 的干细胞 胞质体， 使用带有滤膜的挤出装置反复挤出， 即得脱 核干细胞微囊泡。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述干细胞包括人源干细胞和非人哺 乳动物源干细胞。 3.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 所述滤膜的孔径为0.2 μm～10 μm。 4.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 所述 挤出装置 选自脂质体挤出器。 5.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 所述 挤出次数 大于等于20次。 6.权利要求1～5任一项所述的制备 方法制备 得到的脱 核干细胞微囊泡。 7.根据权利要求6所述的脱核干细胞微囊泡， 其特征在于， 所述脱核干细胞微囊泡是由 干细胞质膜包裹的含有活性内容物的微纳米级囊泡。 8.根据权利要求7所述的脱核干细胞微囊泡， 其特征在于， 所述活性内容物包括母体干 细胞来源的细胞器和/或生物活性大分子物质； 所述细胞器包括线粒体； 所述生物活性大分子物质包括蛋白质、 核酸分子 。 9.根据权利要求7所述的脱核干细胞微囊泡， 其特征在于， 所述脱核干细胞微囊泡的粒 径为0.2 μm～10 μm， 优选为1.0 μm～10 μm。 10.权利要求6～ 9任一项所述的脱 核干细胞微囊泡在 如下(1)～(3)中的应用； (1)制备组织 修复或辅助修复产品； (2)制备抑制细胞衰老的产品； (3)制备预防或治疗组织损伤导 致的炎症反应的产品。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115537386 A 2一种基于脱核干细胞的促修复微囊泡及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 尤其涉及一种基于脱核干细胞的促修复微囊泡及 其制 备方法和应用。 背景技术 [0002]由于受到各种生理/病理因素的影响， 在很多情况下组织损伤无法实现理想 的再 生修复。 究其原因， 一方面在于组织损伤处的细胞往往存在老化甚至凋亡、 坏死等异常情 况； 另一方面， 损伤部位微环境严重失衡， 长期处于炎症状态， 细胞表型进一步恶化， 正常修 复进程被干扰打断。 因此， 逆转细胞老化， 改善微环境， 是实现组织高效快速修复的关键 。 [0003]干细胞能够分泌多种促修复的生物活性因子， 从而改善损伤处的微环境、 激活组 织修复相关的细胞， 改善其生物功能性； 此外， 干细胞内部含有大量的活性线粒体， 研究表 明， 干细胞能够通过纳米管、 囊泡等， 向损伤的、 线 粒体功能失调的细胞转运活性线 粒体， 从 而恢复细胞 活力， 提高其产能水平， 减少氧化应激的负面影响； 干细胞还具有一定的免疫调 节作用， 因此， 干细胞是组织修复领域最常使用的细胞之一。 但相关技术中， 研究发现将干 细胞移植到组织损伤处以期望其能够进行组织修复时， 发现干细胞很难长期停留在移植处 并按照理想的方向分化， 而且存在致癌致畸风险。 而选择使用其他物质用于促进组织修复 时， 如干细胞分泌的细胞外囊泡， 又存在着很多其他问题， 如通过收集细胞培养上清、 离心 获得细胞外囊泡的方法需要培养大量的干细胞， 步骤繁琐、 成本高、 产量低， 收集到的细胞 外囊泡粒径不均一、 不可控等 等。 因此， 极大地限制了 干细胞在组织 修复方面的实际使用。 发明内容 [0004]本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。 为此， 本发明提出一 种基于脱核干细胞的促修复微囊泡及其制备方法和应用。 本发明中的方法能够直接利用干 细胞使其基于挤出法和具有特定孔径的滤膜的联用实现无核干细胞微囊泡的制备， 相对于 传统方法具有 更显著的技术优势， 且操作简单、 成本低、 产量高、 囊泡粒径均一可控， 具有极 高的应用价 值。 [0005]本发明的第一个方面， 提供一种脱 核干细胞微囊泡的制备 方法， 包括如下步骤： [0006]使用细胞松弛素B对干细胞进行脱核， 利用Percoll离心法或涡旋法分离出脱去细 胞核的干细胞 胞质体， 使用带有滤膜的挤出装置反复挤出， 即得脱 核干细胞微囊泡。 [0007]在本发明的一些实施方式中， 使用Percoll离心法分离出脱去细胞核的干细胞胞 质体。 [0008]在本发明中， 发明人发现， 如果直接将完整的干细胞进行挤出， 细胞核中潜在的风 险基因无法从制备 的囊泡中除去， 后续将囊泡应用在受损组织处时， 存在一定的风险基因 转移的可能。 为了尽可能避免风险基因的转移， 在挤出制备囊泡之前， 将干细胞的细胞核从 细胞中除去是十分有必要的。 [0009]在本发明中， 除去细胞核后的胞质体仍然能够继续维持活性， 且在除去核成分外，说　明　书 1/6 页 3 CN 115537386 A 3