ICS 11.220 CCS B 41 唐 山 市 地 DB1302 方 标 准 DB1302/T 522-2020 生猪屠宰场（点）非洲猪瘟快速检测技术规程 2020-12-28 发布 唐山市市场监督管理局 2021-01-10 实施 发布 DB1302/T 522-2020 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由唐山市农业农村局提出并归口。 本文件起草单位：唐山市动物卫生监督所、唐山市动物疫病预防控制中心、唐山怡安生物工程有限 公司。 本文件主要起草人：刘润东、张玉新、李润、李杏媛、韩泽雨、高英、刘志勇、杨思源、崔荣飞、 毕红全、王大伟、梁宝、李敬阳、代广、张英杰、赵艳华、朱秋艳、徐丽、康晓晓、肖文同。 I DB1302/T 522—2020 生猪屠宰场（点）非洲猪瘟快速检测技术规程 1 范围 本文件规定了生猪屠宰场(点）非洲猪瘟快速检测活动的检测室建设、采样、检测、生物安全和档 案管理等。 本文件适用于生猪屠宰场(点）非洲猪瘟快速检测，其它环节非洲猪瘟快速检测也可参照执行。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 农牧发〔2019〕2 号 生猪屠宰检疫规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 非洲猪瘟快速检测 指利用实时荧光 PCR 的方法，核酸提取、扩增检测均在同一封闭、便携式仪器上完成，样本上机 后至结果报告过程，无需任何手工操作，通过实时监测 PCR 扩增产物的累计过程中荧光信号的变化， 在 90 min 内完成对非洲猪瘟病毒特异性核酸片段的快速检测。 4 检测室建设 4.1 基本要求 4.1.1 检测室应设在相对独立的区域，与其它不相容的区域进行有效隔离，防止交叉污染。 4.1.2 检测室应分为试剂贮存和配制、样品制备和扩增 2 个独立工作区域，有明晰的标识，检测操作 和人流物流按照单一方向流动。 4.1.3 应配备给水、排水、电力、通风、消毒及无害化处理设施。 4.1.4 地面平整防滑、墙面、顶棚平整，易清洁消毒。 4.1.5 工作台表面应耐热、耐腐蚀，可反复清洗消毒。 4.2 仪器设备配置 4.2.1 试剂贮存和配制区 配备超净工作台（通风橱）、冰箱、微量移液器（10 µL、100 µL）。 4.2.2 样品制备和扩增区 1 DB1302/T 522—2020 配备荧光定量 PCR 仪、二级生物安全柜（可选）、高速离心机（可选）、核酸提取仪（可选）、 组织破碎仪、微量移液器（10 µL、100 µL、1000 µL）。 4.3 检测人员 检测人员应取得健康合格证明并在省定点屠宰管理办公室登记备案。 5 采样 5.1 采样人员 采样由经过专业技术机构培训、掌握采样技术的生猪屠宰场（点）人员实施。 5.2 器具及试剂 放血刀具（可选）、离心管（5 mL）、一次性混合血样容器、一次性手套、 一次性注射器（10 mL）、 搅拌棒、编号笔、消毒液容器、抗凝剂（柠檬酸钠:水=1:10）、消毒剂等。 5.3 抽样 屠宰生猪以运输车辆为批次全部采集血液样品，每头生猪采集血液 2 mL。 生猪血样采集在生猪入场前、待宰圈、放血后进行，采样部位为生猪耳缘静脉或前腔静脉。 采样人员戴一次性手套，使用容量为 5 mL 的离心管接取血液，倒入混合血样容器内。 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.4 混样 5.4.1 生猪的血样混合同批不高于 50 头。 5.4.2 混合血样添加 10 mL 抗凝剂，残猪、急宰猪按每头 0.5 mL 添加抗凝剂，用搅拌棒搅拌均匀， 使用一次性注射器从混合均匀的血液中抽取 5 mL 血液送检。 5.5 编号、记录、送样 5.5.1 对每个混合血样进行编号，同日内所有混合血样编号不得重复。用于检测的样品、备份留存的 样品应统一用防水记号笔对应编号，清晰标记于采样容器上，其编号应与生猪的检疫证明号码相对应。 5.5.2 血液样品抽取后做好采样记录，采样记录内容包括采样日期、采样地点、采样头数、对应检疫 证号码、样品类型、样品编号、采样人员等。采样记录样式见附录 A。 5.5.3 混合后的血样应立即送检测室进行检测，特殊情况下混合血样现场放置时间不超过 30 min。 5.6 样品留存 检测样品应留存备份，-20℃保存 1 个月以上。 6 6.1 检测 检测方法 采用农业农村部批准的商品化试剂盒检测，检测操作步骤按照试剂盒及 PCR 仪操作说明书进行。 6.2 结果分析 依据试剂盒操作说明书，通过 Ct 值判定：阳性/阴性。 2 DB1302/T 522—2020 6.3 结果处置 检测结束后，如实填写检测报告，检测报告样式见附录 B。结果处置按《生猪屠宰检疫规程》中 7.1 和农业农村部实时发布的非洲猪瘟疫情防控相关文件执行。 7 生物安全 7.1 采样工具用流动的清水冲洗干净，并用消毒剂消毒，取完一个批次的样品后进行更换、消毒；一 次性手套、离心管、混合血样容器在取完一个批次的样品后更换，采样产生的废弃物放入密封、无渗漏 的容器内，应进行无害化处理。 GB 19489 给出了无害化处理的方法。 7.2 检测室内保持整洁干净，严禁摆放与检测无关的物品，不得在检测室内进行与检测无关的活动。 7.3 检测操作前开启紫外灯至少照射 30 min，对室内空间、工作台面、地面及设备仪器等表面进行消 毒。 7.4 检测人员进入检测区域应做好人员防护。 7.5 检测产生的废弃物、剩余样品及使用过的移液枪头、一次性手套、口罩、帽子等应进行无害化处 理。 GB 19489 给出了无害化处理的方法。 7.6 需样品制备及核酸提取的，应在二级生物安全柜中进行。 7.7 检测结束后应采取紫外照射或消毒液喷洒等措施对环境进行消毒。 7.8 扩增后装有反应产物的 PCR 反应管禁止开盖，立即消毒，检测结束与其它高压灭菌后的废弃物送 出检测室。 7.9 检测室发现污染应停止检测活动。 8 档案管理 8.1 8.2 应建立人员培训、采样检测记录、检测报告等相关档案。 档案保存不少于 12 个月。 3 DB1302/T 522—2020 附 录 A (资料性） 生猪屠宰场（点）非洲猪瘟检测采样记录表 表 A.1 给出了生猪屠宰场（点）非洲猪瘟检测采样记录表的样式 表 A.1 生猪屠宰场（点）非洲猪瘟检测采样记录表 编号：（年月日+3 位数顺序号） 序 号 日期 采样 采样 地点 头数 对应检疫证号码 样品 类型 注：1、采样地点填写入场前、待宰圈或屠宰线； 2、采样头数为 1 头或多头，相应的样品编号为 1 个号码或号段； 3、样品类型为血样、脾、淋巴结或肾等。 4 样品编号 采样人（签字） 备注 DB1302/T 522—2020 附 录 B (资料性） 生猪屠宰宰场（点）非洲猪瘟自检报告 表 B.1 给出了生猪屠宰场（点）非洲猪瘟自检报告的样式 表 B.1 生猪屠宰场（点）非洲猪瘟自检报告 编号：（年月日+3 位数顺序号） 采样表编号 检测生猪数 样品编号 对应检疫证号码 试剂名称 生产厂家 有效期至 混样记录 检测方法 检测结果（详细 记录阴阳性情况 及对应检疫证号 码） 屠宰场检测人（签名）： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 屠宰场负责人（签名并盖章）： 官方兽医确认（签名）： 5 DB1302/T 522—2020 参 [1] [2] 6 考 文 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 763-2004 猪肉、猪肝、猪尿抽样方法 献