ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3321—2018 饲料中L一肉碱的测定 Determination of L-Carnitine in feeds 行业标准信息服务平台 2018-12-19发布 2019-06-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 3321—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所国家饲料质量监督检验中心 (北京）]。 本标准主要起草人：索德成、张苏、田静、魏书林、王瑞国、赵根龙、王石、樊霞 行业标准信息服务平台 I NY/T3321—2018 饲料中L-肉碱的测定 1范围 本标准规定了配合饲料、添加剂预混合饲料，浓缩伺料中L-肉碱的方法。 本标准中第一法离子色谱法适用于添加剂预混合饲料、浓缩饲料中L-肉碱的测定；第二法液相色 谱-串联质谱法适用于配合饲料浓缩饲料中工肉碱的测定 2规范性引用文件 ARD 下列文件对于本文件自 的应用是 是 件。凡是不注日期的引 用文怀其 最新 本（包括所有的修改单） 析实验室 门水规格和武验 GB/T 6682 饲料 采样 GB/T14699. GB/T 20195 动物饲 试样的制备 3第一法 离子食 色谱法 R 3.1原理 试样中的L 过膜后，去适量体积或适度稀释， 谱分 离测定，外 标法定量。 3.2试剂或材料 除非另有规定 分机中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB 3.2.1甲磺酸 3.2.2盐酸溶液 HCO mL盐酸于1000m 至刻度。 容居瓶 3.2.3L-肉碱盐酸五标灌品 3.2.4L-肉碱盐酸盐标准储备 确称取 g精确至:0：0001g 1050 恒重的L-肉碱盐酸 盐标准品于100mL容量瓶中，用甲醇容解开定容 该标准浴液的浓度为1mg /mL。2℃~8℃冷藏保 存，有效期12个月。 3.2.5L-肉碱盐酸盐标准工作液：精密量取适量L-肉碱盐酸盐标准储备液（3.2.4)置于棕色容量瓶 中，用水稀释成浓度为2μg/mL、5μg/mL 10ug/mL20//mL.50ug/mL、100μg/mL的L-肉碱盐 3.2.6流动相（1.5mmol/L甲磺酸水溶液：乙=90：10）：称取2.88g甲磺酸（精确至0.01g），用 水定容至1000mL，该溶液浓度为30mmol/L。取50mL该溶液，加入100mL乙睛，用水定容至 1 000 mL。 3.3仪器设备 3.3.1离子色谱仪，带有电导检测器。 3.3.2天平：感量0.0001g和0.01g各一台。 3.3.3离心机：转速大于5000r/min。 3.3.4超声波提取器。 3.3.5滤膜：0.45μm，水系。 1 NY/T3321—2018 3.4样品 按GB/T14699.1的规定采集样品。 选取有代表性饲料样品至少500g，按GB/T20195的规定制备样品。 3.5试验步骤 3.5.1提取 称取预混合饲料试样2g（精确至0.01g），置于100mL容量瓶中，加人80mL水，混合后置于振荡 器上剧烈振荡或超声提取30min，静置10min，定容，离心或过滤，用水稀释使其浓度在2μg/mL～100 μg/mL，过0.45μm滤膜，上机测定。 3.5.2测定 3.5.2.1色谱条件 色谱柱：非抑制型阳离子交换分离柱（长250mm，内径4mm）或性能相当的其他分析柱。 流速：1.0mL/min。 柱温：40℃。 进样量：25L。 检测器：电导检测器。 3.5.2.2测定 待IC分析仪基线平稳后，连续注人L-肉碱标准溶液，直至得到峰面积能够重现的色谱峰。 依次注人标准、试样溶液，以色谱峰的保留时间定性、峰面积积分值定量，用标准系列进行单点或多 点校准。样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。 3.6试验数据处理 试样中L-肉碱含量以质量分数X，表示，单位为毫克每千克（mg/kg），按式（1)和式（2)计算。 (1) mX1000 式中： C: 试样溶液中L-肉碱浓度，单点校准时由式（2）计算得到，多点校准时从标准曲线查得， 单位为微克每毫升（ug/mL）； V 试样的提取液总体积，单位为毫升（mL）； n 稀释倍数 试样的质量，单位为克（g）； m 0.815 -L-肉碱与L-肉碱盐酸盐的换算关系。 CXA (2) A 式中： C一混合标准工作液中L-肉碱浓度，单位为微克每毫升（μug/mL）； A,一试样溶液中L-肉碱的峰面积； A 一混合标准工作液中L-肉碱的峰面积。 测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。 如需分析饲料中L-肉碱是否含有D-肉碱成分，可参考附录A的方法进行分离鉴别。 3.7精密度 在重复性条件下，获得的2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。以大于10%的情况不超过5%为前提。 4第二法液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS) 4.1原理 2 NY/T 3321—2018 用盐酸溶液提取样品中的L-肉碱，用固相萃取柱净化后，使用液相色谱串联质谱分离测定，内标法 定量。 4.2试剂或材料 除方法另有规定外，试剂均为分析纯，实验室用水符合GB/T6682中一级水的规定。 4.2.1乙睛：色谱纯。 4.2.2甲酸：色谱用。 4.2.3L-肉碱-D3盐酸盐对照品：纯度> 4.2.4L-肉碱盐酸盐对照品：纯度 ≥98% 4.2.5Cl8固相萃取柱：3ml 60ing PUBL 4.2.60.3%甲酸溶液 胶甲酸 ml 4.2.7稀释液：取0. LOm mE 4.2.8L-肉碱盐酸 热标 主储备（ 酸起0 准确称取 用甲醇配制成100μg/ mL的标准储备液 避光保 有效期为12个月。 4.2.9L-肉碱盐酸盐标准中间液1 备浴液（ 肉碱盐 酸盐标准 2.9 9）,用甲醇稀释 成1μg/mL, 8℃ 避光保存 有效期为 S 4.2.10L-肉碱盐 酸盐标 准工作浴液根据需要 o 分别吸取标准中间液 1. 适量 量，用稀释液 (4.2.8)稀释成浓度为% g/m mL的标准 ugmL ugimL 工作溶液，现配现 R 4.2. 11 L-肉碱 酸盐对照品 0.1g，用甲 醇配制成100 mL的内标储备液，18℃避光保存备用，有效期为12个月 工 4.2.12L-肉碱 12），用甲醇 稀释成1μg/m 187 保存有效 4.3仪器设备 C 4.3.1实验室常用 4.3.2电子天平 .1900 4.3.3 离心机：可达 4.3.4 超声水浴。 4.3.5 固相萃取装置。 4.3. 6 高效液相色谱串联质谱仪：配电喷雾离宇源（ES 4.3.7 氮吹装置。 4.3.8 有机滤膜：0.22μm。 4.4样品 同3.4。 4.5试验步骤 4.5.1试样提取 称取饲料试样2g（精确到0.001g），置于50mL离心管中，准确加人盐酸溶液20mL，充分摇动 30s，再置于超声水浴中超声提取20min，期间摇动2次。取出后，于离心机上5000r/min离心5min， 备用液。 4.5.2试样净化 3 NY/T3321—2018 固相萃取柱（4.2.5)分别用1mL甲醇和1mL水活化，准确移取5mL备用液（4.5.1)过柱，弃去初 滤液1mL～2mL，收集剩余流出液至10mL试管内，过0.22μm滤膜后，上机测定。若样品液中含有的 药物浓度超出线性范围，进样前用一定体积的稀释液稀释，使稀释后上机液中的药物浓度在线性范 围内。 4.5.3测定 4.5.3.1液相色谱参考条件 色谱柱：非抑制性阳离子交换分离柱（长250mm，内径4mm）或性能相当的其他分析柱。 柱温：30℃。 流动相：0.3%甲酸溶液：乙睛=90：10 流速：0.80mL/min。 进样量：10μL。 4.5.3.2质谱参考条件 离子源：电喷雾离子源。 扫描方式：正离子扫描。 检测方式：多反应监测MRM。 使用前，应调节各气体流量，以使质谱灵敏度达到检测要求。 质谱参数应优化至最佳。 定性离子对、定量离子对及碰撞能量的参考值见表1。 表1L-肉碱的定性、定量离子对及碰撞能量的参考值 名称 定性离子对，m/2 定量离子对，m/z 参考碰撞能量，eV 163.2/102.9 12 L-肉碱 163.2/102.9 163.2/93.2 15 L-肉碱-D3 165/105.1 165/105.1 12 4.5.3.3定性测定 每种被测组分选择1个母离子、2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间 与标准溶液中对应的保留时间偏差在士0.5之内，且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接 近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品 中存在对应的待测物。 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许误差 单位为百分率 相对离子丰度 >50 20~50（含） 10~20（含） ≤10 允许的最大偏差 ±30 ±30 ±30 ±30 4.5.3.4定量测定 在仪器最佳工作条件下，取试样溶液和标准溶液分别进样，以标准溶液中被测组分峰面积为纵坐 标、被测组分浓度为横坐标，用标准系列进行单点或多点校准，采用内标法对样品进行定量。样品溶液 中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，以L-肉碱-D3为内标物计算L-肉碱含量。上述色 谱和质谱条件下，L-肉碱以及内标物L-肉碱-D3标准物质的多反应监测色谱图参见附录B。 4.6试验数据处理 试样中L-肉